来源：Discovered potential of biomass Eucalyptus deglupta blume: In Vitro and In Silico antimicrobial evaluation against Bacillus subtilis and Escherichia coli（Sustainable Chemistry for the Environment）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
抗菌耐药（AMR）已成为全球公共卫生的重大威胁。本研究以东南亚特有的桉树物种 Eucalyptus deglupta Blume 为对象，采用溶剂极性梯度超声辅助提取（UAE）策略，系统评价其叶与枝条提取物对枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）和大肠杆菌（Escherichia coli）的抗菌活性，并结合GC-MS/LC-MS代谢物谱解析与PPI网络引导的多靶点分子对接。枝条甲醇提取物对大肠杆菌MIC低至0.10 mg/mL，抑菌圈直径达23.87 mm，超过阳性对照氯霉素。该工作将木质纤维素废弃生物质的极性分级生物精炼与抗AMR多靶点预测相结合，为可持续生物基抗菌平台开发提供了新思路。
研究背景
抗菌耐药（AMR）是当今全球公共卫生面临的最严重威胁之一。2019年，AMR直接导致约127万人死亡，并促成近495万人死亡；预测到2050年，直接归因死亡将升至191万。感染治疗长期高度依赖抗菌剂——即能够抑制微生物生长或诱导微生物死亡的化学化合物。当微生物对曾有效的药物获得防御机制时，便产生AMR，导致治疗失败、发病率上升和医疗成本大幅增加。
AMR威胁的加剧凸显了两方面需求：一是开发新型抗菌策略的紧迫性，二是减少对化石来源合成化学品依赖的广泛挑战。在此背景下，木质纤维素和脂质生物质——特别是林业、农业和食品工业的废弃物流——为生产生物基精细化学品、药物和抗菌剂提供了有前景的可再生原料。通过生物精炼实现这类生物质的增值，不仅解决废物管理问题，也为开发下一代治疗药物提供了可持续路径。
在木质纤维素生物质来源中，Eucalyptus deglupta Blume 作为一个独特但尚未充分开发的候选者脱颖而出。该物种是东南亚特有的桉树物种，其生物质废弃物的抗菌潜力此前缺乏系统的体外与计算机模拟整合评价。
研究方法
2.1 材料
所用材料为干燥叶片和枝条、正己烷（Merck）、乙酸乙酯（Merck）、甲醇（Merck）、Mueller Hinton琼脂（MHA）、营养肉汤（NB）、营养琼脂（NA）、二甲基亚砜（DMSO）、蒸馏水、氯霉素（Kalmicetine, Kalbe Farma, 印度尼西亚）、细菌分离株 B. subtilis ATCC 19659 和 E. coli ATCC 8739。
【数据】菌株：B. subtilis ATCC 19659、E. coli ATCC 8739；试剂：正己烷、乙酸乙酯、甲醇、MHA、NB、NA、DMSO、氯霉素；试剂来源：Merck、Kalbe Farma；原文未详述其他参数
2.2 样品制备
植物材料取自种植于IPB大学热带生物制药研究中心栽培单元的10年生 E. deglupta 标本，地理位置为北纬6°32′25.47″、东经106°42′53.22″，海拔142.60 m，位于印度尼西亚茂物；并由万隆理工学院生命科学与技术学院进行分类学鉴定。凭证标本存放于编号BMK0551122024下。收获的植物材料随后于45 °C烘箱干燥，再经机械研磨和过筛，获得40–60目粒径。
【数据】植株年龄：10年；采集地：IPB大学热带生物制药研究中心，北纬6°32′25.47″、东经106°42′53.22″，海拔142.60 m；凭证号：BMK0551122024；干燥温度：45 °C；粒径：40–60目
2.3 水分和灰分含量的重量法测定
干燥叶片和枝条材料的水分和灰分含量按照标准重量法程序测定[11]。
【数据】方法：标准重量法；样品：干燥叶片和枝条；原文未详述具体温度、时间等参数
2.4 提取
干燥叶片和枝条样品采用递增极性溶剂依次提取：正己烷（非极性）、乙酸乙酯（半极性）、甲醇（极性）和蒸馏水（高极性）。提取采用超声辅助提取（UAE）（BIOBASE-250W，220 V，50 Hz，40 kHz），40 °C、30 min，固液比1:10（w/v，g/mL）。每种植物部位–溶剂组合提取三份平行。所得混合物经Whatman No. 1滤纸过滤，并使用旋转蒸发仪减压浓缩。最终提取物称重以确定提取率（%）。GC-MS测定正己烷和乙酸乙酯提取物的植物化学谱，甲醇和水提取物则通过LC-MS表征[12]。
【数据】溶剂：正己烷、乙酸乙酯、甲醇、蒸馏水；提取方法：UAE（BIOBASE-250W，220 V，50 Hz，40 kHz）；温度：40 °C；时间：30 min；固液比：1:10（w/v，g/mL）；平行数：3；滤纸：Whatman No. 1；分析手段：GC-MS（正己烷、乙酸乙酯提取物）、LC-MS（甲醇、水提取物）
2.5 体外抗菌活性
#### 2.5.1 抗菌活性测定（扩散法）
抗菌试验使用 E. coli（ATCC 8739）和 B. subtilis（ATCC 19659）。所有涉及细菌菌株的实验均在IPB大学机构生物安全（BSL-2）批准下、按照机构生物安全方案进行。细菌接种物最初在营养琼脂培养基上生长，随后转移至10 mL营养肉汤培养基中，37 °C孵育24 h。提取物以10000 µg/mL浓度用于抗菌测定，细菌悬液标准化至10⁸ CFU/mL浓度后接种于Mueller Hinton琼脂（MHA）上。每个琼脂平板使用打孔器打六个等距孔，四个用于提取物，一个用于氯霉素（阳性对照），一个用于溶剂（阴性对照）。然后向孔中加入50 µL各提取物。平板于37 °C孵育18–24 h。随后测量提取物对测试菌的抑菌圈平均直径以评价抗菌活性[13]。
【数据】菌株：E. coli ATCC 8739、B. subtilis ATCC 19659；生物安全等级：BSL-2；预培养：营养琼脂→10 mL营养肉汤；预培养温度：37 °C；预培养时间：24 h；提取物浓度：10000 µg/mL；细菌悬液浓度：10⁸ CFU/mL；培养基：MHA；每板孔数：6（4提取物+1氯霉素+1溶剂）；每孔加样量：50 µL；孵育温度：37 °C；孵育时间：18–24 h
#### 2.5.2 最低抑菌浓度（MIC）和最低杀菌浓度（MBC）测定
营养肉汤（NB）用作 B. subtilis 和 E. coli 的培养介质。将200 μL各提取物（浓度范围0.156至20 mg/mL）分装至无菌96孔微量滴定板的各孔中。样品溶解于20%二甲基亚砜（DMSO）中。随后，向每孔加入100 μL无菌营养培养基和10 μL细菌接种物（10⁷ CFU/mL）。微量板于37 °C孵育24 h。以孔清澈（无可见细菌生长）的最低测试物浓度记录为最低抑菌浓度（MIC）。为确定最低杀菌浓度（MBC），从无可见生长的孔中取100 μL等分液转移至100 μL新鲜营养培养基中，37 °C再孵育18–22 h。亚培养后无细菌生长的最低浓度指定为MBC。阴性对照为20% DMSO，阳性对照为氯霉素。每种提取物的抗菌活性进行三份平行。结果观察采用可视化方法[12]。MBC定义为亚培养后无可见生长的最低浓度。杀菌活性定义为MBC/MIC ≤ 4；抑菌活性定义为MBC/MIC > 4[14]。
【数据】培养基：NB；提取物浓度范围：0.156–20 mg/mL；每孔提取物体积：200 μL；溶剂：20% DMSO；每孔培养基体积：100 μL；接种物：10 μL，10⁷ CFU/mL；孵育温度：37 °C；孵育时间：24 h；MBC亚培养：100 μL至100 μL新鲜培养基，37 °C，18–22 h；阴性对照：20% DMSO；阳性对照：氯霉素；平行数：3；杀菌标准：MBC/MIC ≤ 4；抑菌标准：MBC/MIC > 4
#### 2.5.3 统计分析
所有实验均进行三份平行（n = 3）。数据以平均值 ± 标准差（SD）表示。采用单因素方差分析（ANOVA）及Duncan多重极差检验（p < 0.05）进行均值比较。统计分析使用SPSS 26版（IBM Corp., Armonk, NY, USA）完成。
【数据】平行数：n = 3；数据表示：mean ± SD；统计方法：单因素ANOVA + Duncan多重极差检验；显著性水平：p < 0.05；软件：SPSS version 26
2.6 GC-MS分析
正己烷和乙酸乙酯提取物的推定化合物分析采用GC-MS进行。将1–2 mg干燥提取物置于玻璃瓶中，用50 µL BSTFA/TMSCl（99/1）硅烷化，随后于70 °C加热12 h。然后蒸发衍生化试剂，提取物衍生物用1 mL乙酸乙酯稀释后转移至气相色谱仪。分析使用Clarus 680气相色谱仪与Clarus SQ8四极杆质谱仪（Perkin Elmer Inc., Waltham, MA, USA）联用，配备熔融石英毛细管柱（DB-5ms，30 m × 0.25 mm，0.25 µm膜厚，J&W Scientific, Folsom, CA, USA），含5%二苯基和95%二甲基聚硅氧烷。氦气用作载气，恒定流速1 mL/min。样品进样（1 µL）在250 °C下以不分流模式进行。柱温程序从80 °C开始（保持2 min），以10 °C/min升至190 °C，再以15 °C/min升至280 °C（保持5 min），最后以10 °C/min升至300 °C（保持14 min）。电离在电子轰击模式下以70 eV进行，源温和传输线温度分别为180 °C和250 °C。检测以扫描模式进行（分子量45–700 Da），溶剂延迟2 min。化合物通过将其谱图与NIST质谱库（2011版）比较进行鉴定。方法遵循先前研究程序。化合物通过将其谱图与NIST质谱库（2011版）比较进行鉴定[13]。
【数据】样品量：1–2 mg；衍生化试剂：50 µL BSTFA/TMSCl（99/1）；衍生化温度：70 °C；衍生化时间：12 h；稀释溶剂：1 mL乙酸乙酯；色谱柱：DB-5ms（30 m × 0.25 mm，0.25 µm）；载气：氦气；流速：1 mL/min；进样量：1 µL；进样温度：250 °C；进样模式：不分流；柱温程序：80 °C（2 min）→10 °C/min→190 °C→15 °C/min→280 °C（5 min）→10 °C/min→300 °C（14 min）；电离模式：EI，70 eV；源温：180 °C；传输线温度：250 °C；扫描范围：45–700 Da；溶剂延迟：2 min；数据库：NIST 2011
2.7 LC-MS分析
甲醇和水提取物中的推定化合物采用液相色谱-质谱（LC-MS）分析测定。LC-MS分析使用Shimadzu（Noisiel, France）LC-20A超高效液相色谱（UHPLC）系统，配备自动进样器，连接PDA UV检测器SPD-20A，并与LC-MS 8030三重四极杆质谱仪联用。分离在Luna C18分析柱（内径150 mm × 3 mm；Phenomenex, Le Pecq, France）上以0.4 mL/min流速进行，采用20 min梯度如下：从5%乙腈（含0.1%甲酸）在水（0.1%甲酸溶液）中开始，乙腈比例在10 min内线性增至30%，再在8 min内增至80%，维持1 min。然后在1 min内回到初始条件。进样体积为1 µL。紫外-可见光谱在190至800 nm之间记录。正离子和负离子电喷雾质谱分析在100至2000 m/z之间以单位分辨率进行，扫描速度15,000 amu/s。加热块和脱溶剂线温度分别为400 °C和250 °C。氮气用作干燥气（15 L/min）和雾化气（3 L/min）。离子喷雾电压为+/− 4500 V。
【数据】系统：Shimadzu LC-20A UHPLC + PDA SPD-20A + LC-MS 8030三重四极杆；色谱柱：Luna C18（150 mm × 3 mm）；流速：0.4 mL/min；梯度：5%乙腈→10 min至30%→8 min至80%→维持1 min→1 min回到初始；进样量：1 µL；UV范围：190–800 nm；MS扫描范围：100–2000 m/z；扫描速度：15,000 amu/s；加热块温度：400 °C；脱溶剂线温度：250 °C；干燥气：氮气，15 L/min；雾化气：氮气，3 L/min；离子喷雾电压：+/− 4500 V
研究结果
3.1 提取率
枝条材料的水分含量（5.39 ± 0.09%）低于叶片材料（7.57 ± 0.18%），归因于枝条组织的木质化、木质性质。灰分含量同样在枝条中较低（2.58 ± 0.51%），叶片中较高（4.83 ± 0.03%）。叶提取物的提取率普遍高于枝条提取物（表1），这与叶片组织比木质化枝条生物质含有更多可溶性次生化合物一致。极性溶剂（甲醇、水）产出的提取物量最大，与关于 E. globulus 的报道一致，即甲醇产量高于正己烷[20]。此外，本研究采用的提取过程也代表了可持续绿色化学原理的应用，因为利用常被视为农业或林业副产品的叶片和枝条生物质回收有价值的生物活性化合物，支持废物增值、减少环境负担，并促进环境友好的天然产物提取方法[21]。除此之外，本研究采用的UAE方法相比传统提取具有多项可持续性优势：缩短提取时间（30 min vs 浸渍通常2–6 h）和能源效率。甲醇（最有效溶剂）可通过旋转蒸发回收和循环使用，回收效率> 90%[4]。
【数据】枝条水分：5.39 ± 0.09%；叶片水分：7.57 ± 0.18%；枝条灰分：2.58 ± 0.51%；叶片灰分：4.83 ± 0.03%；UAE时间：30 min；传统浸渍时间：2–6 h；甲醇回收效率：> 90%
3.2 体外抗菌活性
革兰氏阳性菌（B. subtilis）具有厚的肽聚糖细胞壁，对亲脂性化合物相对可渗透；而革兰氏阴性菌（E. coli）具有额外的含脂多糖（LPS）的外膜，构成对许多生物活性剂的选择性屏障。这种结构差异从根本上影响了有效抗菌活性所需的提取物类型和化合物极性[22]，也是解释各提取物观察到的差异活性模式的主要框架。枝条提取物对 B. subtilis 的抑菌圈直径（IZD）值范围为2.90（叶正己烷，LN）至18.83 mm（枝条正己烷，TN）（图1）。IZD 15–25 mm被归类为强活性[20]。正己烷枝条提取物（TN）产生最高IZD（18.83 mm），可能与亲脂性倍半萜化合物——如GC-MS鉴定的(±)-trans-nerolidol和bisabolol——有关，这些化合物可能穿透肽聚糖层并可能与革兰氏阳性菌的细胞质膜相互作用，可能导致细胞内含物泄漏[23]。对 E. coli，甲醇枝条提取物（TM）产生最高IZD（23.87 mm）。枝条提取物在使用相同溶剂时始终显示等于或大于叶提取物的IZD值，与一项涵盖739种植物物种的系统综述一致，即茎和皮在统计学上表现出比叶更高的抗菌活性[24]。
MIC和MBC是体外评价植物提取物抗菌活性的两个重要定量参数。这两个参数补充抑菌圈直径数据，因为MIC和MBC提供关于抗菌剂有效性的更精确的定量信息[25]。本研究中对MIC与MBC关系的解释采用MBC/MIC比值方法对抗菌特性进行分类。如果MBC/MIC比值≤ 4，该剂归类为杀菌性；如果MBC/MIC比值> 4，则归类为抑菌性[14]。八种 E. deglupta 提取物对 B. subtilis 的MIC测试结果显示高度变化的范围，从0.37 mg/mL到20.00 mg/mL（表2）。杀菌活性（MBC/MIC ≤ 4）由叶乙酸乙酯提取物（LE）对两种细菌（MBC/MIC = 1）和叶甲醇提取物（LM）对 E. coli（MBC/MIC = 2.70）表现。枝条甲醇提取物（TM）对两种细菌均为抑菌性（MBC/MIC > 4）。枝条甲醇提取物（TM）表现出最低MIC值（0.10 mg/mL），约比已发表的 E. radiata 精油对 E. coli 的MIC值（0.5–1.0 mg/mL）低5倍[26]。甲醇提取物的优越性与甲醇的半极性性质一致，甲醇提取更广泛的两亲性化合物——包括黄酮类、可水解单宁和酚酸——这些化合物可能能够穿透革兰氏阴性菌的LPS外膜[27]。
为将本研究结果置于当前文献中并阐明本工作的新颖性，表3将 E. deglupta 枝条甲醇提取物的抗菌活性与近期（2015–2025）关于其他桉树物种的报道进行比较。此处对 E. coli 获得的IZD值（23.87 mm）超过 E. camaldulensis 乙醇叶提取物报道的值（14.0 mm）[28]，并且使用的是粗的、未分级的甲醇提取物而非分离的精油，使本工作区别于基于精油的研究，如近期三种桉树物种花序精油对多重耐药革兰氏阴性菌的筛选[29]。与大多数先前桉树抗菌报道（仅表征单一提取物类型或分离精油）不同，本研究还整合了PPI网络引导的多靶点分子对接，据我们所知，此前尚未将该方法与针对该属的溶剂极性基体外筛选相结合；这种体外–计算机模拟双重、多溶剂设计构成本工作相对于表3比较研究的主要新颖性。
E. deglupta 提取物对 E. coli 的抗菌活性通过涉及各类生物活性化合物的多靶点机制以协同方式运作。甲醇和乙酸乙酯提取物中的酚类化合物通过外膜LPS去稳定化、抑制DNA旋转酶、抑制外排泵以及通过调控群体感应基因破坏生物膜形成发挥作用[31]。正己烷提取物中的萜类化合物通过跨膜电化学梯度崩溃和内膜去稳定化发挥作用[32]。这种机制的多样性代表了植物基抗菌剂的关键优势，因为细菌难以同时对多个不同靶点产生耐药性[33]。基于抗菌活性结果，E. deglupta 的生物质废弃物含有可根据极性选择性提取的高价值生物活性化合物。从可持续化学视角，利用这种绿色废弃物符合循环经济原则，即未利用的生物质残余物转化为增值的生物基抗菌产品，同时减少对合成抗生素的依赖和与有机废物积累相关的环境负担。这些发现因此证实，E. deglupta 的枝条和叶片废弃物有潜力通过环境友好的极性基提取方法开发为天然抗菌原料的可持续来源[4,32]。
【数据】对 B. subtilis IZD范围：2.90（LN）–18.83 mm（TN）；强活性IZD标准：15–25 mm；对 E. coli 最高IZD：23.87 mm（TM）；B. subtilis MIC范围：0.37–20.00 mg/mL；LE对两种菌MBC/MIC = 1；LM对 E. coli MBC/MIC = 2.70；TM对两种菌MBC/MIC > 4；TM对 E. coli MIC：0.10 mg/mL；E. radiata 精油对 E. coli MIC：0.5–1.0 mg/mL；E. camaldulensis 乙醇叶提取物IZD：14.0 mm；杀菌标准：MBC/MIC ≤ 4；抑菌标准：MBC/MIC > 4
3.3 基于GC-MS和LC-MS的 *E. deglupta* 推定化合物
推定化合物分析采用GC-MS对正己烷和乙酸乙酯提取物，LC-MS对甲醇和水提取物。对 E. deglupta 四种非极性和半极性提取物的GC-MS分析鉴定出五种预测化合物，均属于倍半萜类，即(±)-trans-nerolidol、τ-muurolol、globulol和bisabolol（表4）。倍半萜类在所有四种提取物中的优势与所用溶剂的性质一致，即选择性提取亲脂性组分。倍半萜类是从法尼基焦磷酸合成的具有C₁₅碳骨架的次生代谢物。
【数据】分析手段：GC-MS（正己烷、乙酸乙酯提取物）、LC-MS（甲醇、水提取物）；GC-MS鉴定化合物数：5；化合物类型：倍半萜类；鉴定化合物：(±)-trans-nerolidol、τ-muurolol、globulol、bisabolol；碳骨架：C₁₅；前体：法尼基焦磷酸
3.4 基于PPI网络和分子对接的抗AMR靶点预测
基于最大团中心性（MCC）的10个重要蛋白质网络拓扑分析见图2。颜色表示MCC评分：红色节点为高MCC评分，黄色节点为低MCC评分。通过生物信息学蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络分析选择了六个关键抗AMR蛋白靶点（TolC、AcrA、AcrB、AcrD、FabI和FtsZ），并使用AutoDock Vina 1.5.6进行分子对接。
分子对接结果显示植物化合物与蛋白质的相互作用（图3）。分子对接表明cypellocarpin B可能与FabI（ΔG = −10.872 kcal/mol）和AcrB（ΔG = −10.401 kcal/mol）相互作用，而(±)-trans-nerolidol对AcrB显示最高预测亲和力（ΔG = −11.960 kcal/mol），提示潜在的多靶点抗AMR活性。
【数据】网络分析工具：MCC；重要蛋白质数：10；靶点数：6（TolC、AcrA、AcrB、AcrD、FabI、FtsZ）；对接软件：AutoDock Vina 1.5.6；cypellocarpin B–FabI：ΔG = −10.872 kcal/mol；cypellocarpin B–AcrB：ΔG = −10.401 kcal/mol；(±)-trans-nerolidol–AcrB：ΔG = −11.960 kcal/mol
讨论与解读
本研究首次对 Eucalyptus deglupta Blume——东南亚特有的唯一桉树物种——进行了系统的体外与计算机模拟多靶点抗AMR评价，采用多溶剂生物精炼导向的提取方法。关键发现如下：第一，枝条甲醇提取物对 E. coli 表现出最低MIC（0.10 mg/mL），约比已发表的 E. radiata 精油值（0.5–1.0 mg/mL）低五倍，并具有最高IZD（23.87 mm，超过氯霉素），确立 E. deglupta 枝条生物质作为抗菌剂开发的高优先级候选者。第二，GC-MS和LC-MS谱分析揭示了丰富多样的次生代谢物谱，涵盖倍半萜类、黄酮、黄酮醇、二氢黄酮、酚类、三萜类和甾体类，通过甲羟戊酸和莽草酸途径生物合成。第三，生物信息学引导的PPI网络分析鉴定了六个AMR相关蛋白靶点（TolC、AcrA、AcrB、AcrD、FabI、FtsZ），分子对接表明cypellocarpin B（在FabI处ΔG高达−10.872 kcal/mol）和(±)-trans-nerolidol（在AcrB处ΔG = −11.960 kcal/mol）可能同时与多个耐药相关靶点相互作用，提示潜在的多靶点抗AMR活性，值得生化验证。第四，基于极性的顺序提取方法表明 E. deglupta 枝条木质纤维素废弃物产生具有差异化生物活性的提取物。
编译者解读：该研究的方法学亮点在于将溶剂极性分级提取与PPI网络引导的多靶点对接整合，避免了传统单靶点筛选的局限。桉树废弃枝条的甲醇提取物在粗提物阶段即展现出超越氯霉素的抑菌活性，提示其中存在协同作用的酚类–萜类组合。局限同样明显：对接结果仅提供预测亲和力，缺乏酶抑制或外排泵功能实验验证；体外活性未在多重耐药临床分离株上确认。未来若能在合成生物学框架下解析关键化合物（如cypellocarpin B）的生物合成基因簇，或可实现微生物细胞工厂的异源生产，真正打通从废弃生物质到绿色抗菌剂的可持续路径。
参考来源
期刊：Sustainable Chemistry for the Environment, 2026
DOI: 10.1016/j.scenv.2026.100338
DOI: 10.1016/j.scenv.2026.100338