来源：Harnessing Yarrowia lipolytica as a platform for animal-free and secretory production of human lactoferrin（Bioresource Technology）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
人乳铁蛋白（hLF）是一种具有重要营养与治疗功能的铁结合糖蛋白。微生物重组生产有望替代从牛奶中提取，但高效分泌仍是瓶颈。本研究以解脂耶氏酵母为底盘，通过信号肽工程、分泌相关蛋白共表达与启动子工程，系统提升hLF的分泌能力。研究发现单纯提高基因拷贝数会导致细胞生长受损与形态异常，而增强蛋白折叠与分泌机器则可显著缓解这一负担。最优菌株在摇瓶中分泌409.9 mg/L hLF，在5 L补料分批发酵中滴度达3.14 g/L。
研究背景
乳铁蛋白（LF）属于转铁蛋白家族，是一种80 kDa的糖蛋白，广泛分布于乳汁、唾液等外分泌液、循环血清、白细胞颗粒以及上皮黏膜屏障中。LF具有铁结合、广谱抗菌、免疫调节、抗癌和抗炎等多种生物学功能，因而在婴儿配方奶粉、保健品、营养品和化妆品等领域应用广泛。目前LF的天然来源主要是人乳和牛乳。人初乳中乳铁蛋白浓度超过5 g/L，后期乳汁降至约2–3 g/L；牛初乳约含0.8 g/L，成熟牛乳仅0.03–0.49 g/L。从天然来源中提取纯化LF需要复杂的色谱或膜分离工艺，回收率低且生产成本高。人乳铁蛋白（hLF）与牛乳铁蛋白（bLF）氨基酸序列同一性约70%，但细微的结构和翻译后修饰差异可能引发人体免疫反应。因此，开发可扩展、无动物源的重组hLF生产平台具有重要意义。
研究方法
2.1 菌株与培养基
质粒构建、扩增和维持在大肠杆菌DH5α（Sangon，中国）中进行。亮氨酸营养缺陷型解脂耶氏酵母菌株Po1g用作重组hLF的表达宿主。LB培养基（Hopebiol，中国）用于培养大肠杆菌。酵母转化子的筛选在CSM-Leu平板上进行，该平板由20 g/L葡萄糖（Macklin，中国）、5 g/L硫酸铵（Macklin，中国）、1.7 g/L无硫酸铵YNB（Sunrise Science，美国）、0.7 g/L CSM-leu补充剂（Sunrise Science，美国）和20 g/L琼脂（Sangon，中国）配制。种子培养在相应的无琼脂液体培养基中进行。摇瓶中的重组酵母发酵在YPD肉汤中进行，配方为40 g/L葡萄糖（Macklin，中国）、10 g/L酵母提取物（Oxoid，英国）和20 g/L蛋白胨（Sangon，中国）。
【数据】菌株：大肠杆菌DH5α、解脂耶氏酵母Po1g；培养基：LB、CSM-Leu、YPD；葡萄糖：20 g/L（CSM-Leu）、40 g/L（YPD）；硫酸铵：5 g/L；YNB：1.7 g/L；CSM-leu：0.7 g/L；琼脂：20 g/L；酵母提取物：10 g/L；蛋白胨：20 g/L
2.2 质粒构建
#### 2.2.1 构建表达不同信号肽的HLF质粒
整合型质粒pYLSC3-XPR2pre携带由杂合启动子hp4d、信号肽XPR2pre和终止子XPR2t组成的分泌表达单元，为本实验室先前保存；质粒pYLSC3′为缺失XPR2pre信号肽的版本（Wu, 2025）。质粒pYLSC3-hLFsp、pYLSC3-Lip2pre、pYLSC3-Lip2pre3xLA、pYLSC3-SP1、pYLSC3-SP3、pYLSC3-SP4和pYLSC3-SP207通过Gibson组装将预退火的引物对（hLFsp-F/hLFsp-R、Lip2pre-F/Lip2pre-R、Lip2pre3xLA-F/Lip2pre3xLA-R、SP1-F/SP1-R、SP3-F/SP3-R、SP4-F/SP4-R和SP207-F/SP207-R）与HindIII/KpnI线性化的pYLSC3′连接构建（Wu, 2025; Gibson, 2009）。在SPs下游添加XbaI和KpnI识别位点以便插入目标基因。Gibson组装使用2×Seamless Cloning Mix（Beyotime，中国）进行。质粒pYLSC3-XPR2prepro通过PCR扩增的XPR2pro片段（使用引物对XPR2pro-F/XPR2pro-R）与SfiI/KpnI线性化的pYLSC3-XPR2pre经Gibson组装连接构建。质粒pYLSC3-Lip2prepro通过预退火引物对Lip2pro-F/Lip2pro-R与XbaI/KpnI线性化的pYLSC3-Lip2pre经Gibson组装构建。在XPR2prepro和Lip2prepro下游添加HindIII和KpnI识别位点。编码成熟hLF（氨基酸20–710）的HLF基因（Uniprot ID: P02788）经解脂耶氏酵母密码子优化后由Genewiz（苏州，中国）化学合成。使用正向引物XPR2pre-hLF-F、hLFsp-hLF-F、Lip2pre-hLF-F、Lip2pre3xLA-hLF-F、SP1-hLF-F、SP3-hLF-F、SP4-hLF-F、SP207-hLF-F、XPR2prepro-hLF-F和Lip2prepro-hLF-F与反向引物hLF-R扩增片段，然后通过Gibson组装插入带有相应SPs的线性化骨架载体，分别得到pYLSC3-XPR2pre_hLF、pYLSC3-hLFsp_hLF、pYLSC3-Lip2pre_hLF、pYLSC3-Lip2pre3xLA_hLF、pYLSC3-SP1_hLF、pYLSC3-SP3_hLF、pYLSC3-SP4_hLF、pYLSC3-SP207_hLF、pYLSC3-XPR2prepro_hLF和pYLSC3-Lip2prepro_hLF。编码C端6xHis标签hLF的质粒pYLSC3-Lip2pre3xLA_hLF6H通过PCR扩增的HLF片段（使用引物对Lip2pre3xLA-hLF-F/hLF6H-R）与XbaI/KpnI线性化的pYLSC3-Lip2pre3xLA经Gibson组装连接构建。对于TurboGFP表达，TurboGFP编码序列从本实验室保存的质粒中扩增（Hong, 2025），通过Gibson组装插入SfiI/KpnI线性化的pYLSC3-XPR2pre，生成pYLSC3-XPR2pre_TurboGFP。
【数据】质粒骨架：pYLSC3-XPR2pre、pYLSC3′；启动子：hp4d；信号肽：XPR2pre、XPR2prepro、Lip2pre、Lip2prepro、Lip2pre3xLA、hLFsp、SP1、SP3、SP4、SP207；终止子：XPR2t；限制性酶：HindIII、KpnI、XbaI、SfiI、NotI、AvrII、SalI、NheI；Gibson组装试剂：2×Seamless Cloning Mix（Beyotime）；HLF基因：Uniprot ID P02788，氨基酸20–710；密码子优化与合成：Genewiz（苏州）；标签：C端6xHis
#### 2.2.2 构建含不同拷贝数HLF表达盒的质粒
设计有Yalibrick特征的质粒pYLSC3可通过将AvrII/SalI产生的供体插入片段连接到NheI/SalI线性化的受体质粒来构建多基因表达盒（Wu, 2025; Wong, 2017）（见补充材料）。具体而言，hLF表达盒通过AvrII/SalI双酶切从pYLSC3-Lip2pre3xLA_hLF质粒中释放。该片段与NheI/SalI线性化的pYLSC3-Lip2pre3xLA_hLF使用T4连接酶（Vazyme，中国）连接，得到双拷贝构建体pYLSC3-Lip2pre3xLA_hLFx2。以pYLSC3-Lip2pre3xLA_hLFx2为受体载体重复该克隆循环，生成三拷贝和四拷贝衍生物pYLSC3-Lip2pre3xLA_hLFx3和pYLSC3-Lip2pre3xLA_hLFx4。相同方法用于生成携带不同拷贝数TurboGFP表达盒的质粒。
【数据】限制性酶：AvrII、SalI、NheI；连接酶：T4连接酶（Vazyme）；拷贝数：1–4拷贝；质粒：pYLSC3-Lip2pre3xLA_hLFx2、x3、x4
#### 2.2.3 构建共表达HLF和分泌相关蛋白的质粒
质粒pYL24携带强启动子pTDH1和终止子MIG1t（Gu, 2024），用作构建分泌相关蛋白表达盒的骨架。例如，质粒pYL24-ylCNE1通过将ylCNE1基因（使用引物yl24-ylCne1-F/yl24-ylCne1-R从Po1g基因组PCR扩增）经Gibson组装插入XbaI/KpnI线性化的pYL24构建。对于HLF与ylCNE1的共表达，ylCNE1表达盒使用引物Sub-F/Sub-R从pYL24-ylCNE1扩增，插入NheI/SalI线性化的pYLSC3-Lip2pre3xLA_hLF，得到双表达质粒pYLSC3-Lip2pre3xLA_hLF-ylCNE1。为构建同时表达HLF和多个分泌相关蛋白的质粒，采用迭代组装策略。例如，质粒pYLSC3-Lip2pre3xLA_hLF-ylHAC1sp-ylCNE1通过将ylCNE1表达盒（使用引物Sub-F2/Sub-R从质粒pYL24-ylCNE1扩增）插入XbaI线性化的pYLSC3-Lip2pre3xLA_hLF-ylHAC1sp生成。其他分泌相关蛋白用相同方法整合到载体中。为提高遗传稳定性，使用替代启动子（pFBA、pGPD1、pEXP1和pTEFin）和终止子（PEX20t、TPI1t）驱动分泌相关基因的表达。使用上述相同策略生成由不同启动子驱动HLF和分泌相关基因同时表达的质粒。本工作中使用的完整质粒和引物列表见支持信息（见补充材料）。
【数据】骨架质粒：pYL24；启动子：pTDH1、pFBA、pGPD1、pEXP1、pTEFin；终止子：MIG1t、PEX20t、TPI1t；分泌相关基因：ylCNE1、ylHAC1sp；限制性酶：XbaI、KpnI、NheI、SalI
2.3 菌株转化
感受态大肠杆菌DH5α细胞用Gibson组装或T4连接反应产物通过常规热激程序转化，阳性筛选在含100 mg/L氨苄青霉素的LB平板上进行。37°C过夜培养后，挑取单菌落通过菌落PCR或酶切验证构建是否成功。对于酵母转化，所有pYLSC衍生质粒首先用NotI线性化，然后通过化学转化法整合到解脂耶氏酵母Po1g菌株的pBR对接平台（Catherine Madzak, 2000）。简要而言，Po1g菌株单菌落在3 mL YPD中30°C培养18 h，取200 μL培养物离心收集（3000 rpm，5 min）。去除上清，细胞沉淀重悬于80 μL 50% PEG4000中，加入5 μL煮沸的鲑鱼精DNA、5 μL 2 M醋酸锂、2.5 μL 2 M DTT和7.5 μL DNA片段。39°C孵育1小时后，转化子涂布于亮氨酸缺陷型CSM-Leu平板，30°C培养至单菌落出现。所有工程酵母菌株编目于支持信息中（见补充材料）。
【数据】大肠杆菌：DH5α；氨苄青霉素：100 mg/L；培养温度：37°C（大肠杆菌）、30°C（酵母）；酵母转化：NotI线性化、PEG4000 50%、醋酸锂2 M、DTT 2 M、39°C孵育1 h；酵母培养：3 mL YPD、18 h
2.4 培养条件与样品收集
#### 2.4.1 摇瓶发酵
将选择性平板上的单菌落转移至CSM-Leu液体培养基中进行种子扩增。30°C培养18–24 h后，通过测量600 nm处光密度（OD600）估算细胞密度。随后将种子培养物接种至含30 mL YPD培养基的250 mL摇瓶中，使初始OD600达到0.1。发酵在250 rpm、30°C条件下进行120 h。结束后记录细胞密度（OD600），培养物在4°C、12000 rpm条件下离心
【数据】种子培养：CSM-Leu液体培养基、30°C、18–24 h；发酵容器：250 mL摇瓶；装液量：30 mL YPD；初始OD600：0.1；转速：250 rpm；温度：30°C；时间：120 h；离心：4°C、12000 rpm
研究结果
3.1 通过信号肽工程优化hLF分泌
hLF的高效分泌需要合适的信号肽（SP）——一段短的N端序列，引导新生多肽进入分泌途径（Owji, 2018）。在解脂耶氏酵母中，异源蛋白的分泌主要由来源于XPR2和Lip2基因的SPs引导（Celinska, 2018; Xingyu Zhu, 2023）。除这些经典SPs外，通过分泌组分析（Yu, 2023）、基因组和转录组数据挖掘（Celinska, 2018）以及突变文库筛选（Wu, 2025）已鉴定出替代SPs。由于解脂耶氏酵母与哺乳动物细胞类似，主要依赖共翻译转运进行蛋白分泌（Celinska and Nicaud, 2019），我们推测hLF的天然信号肽（hLFsp）在该酵母宿主中可能仍具有功能。为评估各种SPs的分泌效率，我们构建了十株解脂耶氏酵母菌株，表达密码子优化的HLF基因与不同SPs的框内融合。这些包括hLF的天然SP（hLFsp）和九种解脂耶氏酵母来源的SPs（XPR2pre、XPR2prepro、Lip2pre、Lip2prepro、Lip2pre3xLA、SP1、SP3、SP4和SP207）（表1），得到菌株Yali-hLF-01至Yali-hLF-10。在所有构建体中，SP_hLF表达盒由杂合启动子hp4d驱动，由终止子XPR2t终止（图1a）。摇瓶培养5天后，收集培养上清进行分析。SDS-PAGE分析显示，十个构建体中只有四个在上清中产生约80 kDa的可检测条带，与hLF的预期大小一致（图1b）。这些条带的身份通过western blotting进一步确认（图1c）。值得注意的是，hLFsp产生了与Lip2pre3xLA相当的信号，尽管其来源于哺乳动物系统。虽然宿主适应性SPs通常有效，但九种解脂耶氏酵母来源的SPs中只有三种能够实现可检测的hLF分泌，凸显了SP性能的上下文依赖性。结果还表明，异源SP可能优于宿主适应性SPs，特别是对于大型且结构复杂的人类糖蛋白。为实现乳铁蛋白的检测和定量，采用HPLC分析（Yao, 2012; Tsakali, 2019），预先用乙腈沉淀（见方法2.6）。使用HPLC，在hLFsp_hLF、XPR2prepro_hLF、Lip2prepro_hLF和Lip2pre3xLA_hLF构建体的样品中检测到明显的hLF峰（图1d），而在其余构建体或非表达对照菌株中未观察到相应峰，与SDS-PAGE和western blot结果一致。通过将商业hLF掺入整合空载体（Po1g-pYLSC3′）的非表达对照菌株培养上清中，评估乙腈沉淀后hLF的回收效率。在测试条件下，该方法对低于200 mg/L的hLF浓度实现了66.63%的回收率（见补充材料）。HPLC-based hLF浓度据此校准，超出线性范围的样品在分析前稀释。定量结果显示，Lip2pre3xLA实现了最高的胞外滴度（73.0 mg/L），其次是hLFsp（59.7 mg/L）（图1e）。常规SPs仅由pre序列组成，通常足以引导蛋白进入分泌途径（Wu, 2025; Celinska, 2018）。然而，我们的结果表明，仅pre序列不足以支持解脂耶氏酵母中hLF的高效分泌。例如，携带XPR2pre和Lip2pre的构建体未能分泌hLF，而其相应的prepro变体（XPR2prepro和Lip2prepro）则实现了可测量的分泌。值得注意的是，表现最佳的SPs——Lip2pre3xLA和hLFsp——均包含19个氨基酸，暗示SP长度可能有助于分泌效率。Lip2pre与Lip2pre3xLA之间的比较进一步表明，延长的二肽片段的存在对分泌性能起重要作用。为验证这一假设，在XPR2pre中引入两个额外的LA二肽重复，生成XPR2pre3xLA（见补充材料）。该工程化SP实现了可检测的hLF分泌，但胞外滴度相对较低，为6.85 mg/L（见补充材料）。为进一步剖析二肽片段的贡献，我们在hLFsp和Lip2pre3xLA之间交换了相应基序，生成hLFsp3xLA和Lip2preLGCA变体（见补充材料）。hLFsp3xLA的分泌效率降低了75.7%，而hLFspLGCA相对于亲本变体仅略有下降（9.3%）（见补充材料），这表明Lip2pre3xLA的N区是稳健的，信号肽酶切割位点附近的具体残基也是高效hLF分泌的关键决定因素。基于其优越且稳健的性能，Lip2pre3xLA被选为后续菌株工程的最佳SP。
【数据】菌株：Yali-hLF-01至Yali-hLF-10；SPs数量：10种；培养时间：5天；hLF分子量：约80 kDa；HPLC回收率：66.63%（hLF<200 mg/L）；最高胞外滴度：Lip2pre3xLA 73.0 mg/L；hLFsp 59.7 mg/L；XPR2pre3xLA 6.85 mg/L；hLFsp3xLA分泌效率降低：75.7%；hLFspLGCA降低：9.3%；SP长度：Lip2pre3xLA和hLFsp均为19个氨基酸
3.2 信号肽切割位点确认
为纯化重组hLF，将C端6xHis标签融合至Lip2pre3xLA_hLF，得到质粒pYLSC3-Lip2pre3xLA_hLF6H（见补充材料）。发酵后，收集携带质粒pYLSC3-Lip2pre3xLA_hLF6H的菌株Yali-hLF6H-06的培养上清，使用Ni-NTA琼脂糖树脂纯化。随后的SDS-PAGE分析确认了纯化产物中hLF的高纯度（图2a）。此外，HPLC分析表明纯化的重组hLF显示与商业hLF相同的保留时间（见补充材料），表明重组hLF成功纯化。为确定Lip2pre3xLA_hLF的信号肽酶（SPase）切割位点，对纯化的重组hLF进行LC-MS/MS分析。蛋白样品分别用Lys-C和Proteinase K消化，所得肽段针对Lip2pre3xLA_hLF6H序列进行分析。Lys-C和Proteinase K消化的序列覆盖率分别达到52.8%和73.7%（见补充材料），进一步确认了分泌的重组hLF的身份。N端片段分别从Lys-C和Proteinase K消化中鉴定为LAGRRRSVQWCAVSQPEATK和LAGRRRSVQWC（图2b-c及见补充材料）。这些结果揭示Lip2pre3xLA信号肽主要在残基17和18之间切割。值得注意的是，来源于信号肽的两个残基Leu-Ala（LA）保留在分泌的重组hLF的N端（图2d）。尽管这两残基延伸很小，但其对hLF结构特性和生物学功能的潜在影响不能排除。需要进一步的生化与功能表征以及安全性评估，以确定重组hLF是否适用于特定的食品或制药应用。
【数据】菌株：Yali-hLF6H-06；质粒：pYLSC3-Lip2pre3xLA_hLF6H；标签：C端6xHis；纯化树脂：Ni-NTA琼脂糖；消化酶：Lys-C、Proteinase K；序列覆盖率：Lys-C 52.8%、Proteinase K 73.7%；N端片段序列：LAGRRRSVQWCAVSQPEATK（Lys-C）、LAGRRRSVQWC（Proteinase K）；切割位点：残基17和18之间；N端残留残基：Leu-Ala
3.3 基因拷贝数对hLF产量的影响
调整基因拷贝数是增强基因表达和重组蛋白生产的常用策略（Wang, 2024）。为实现多拷贝基因组整合，使用Yalibricks组装策略（Wong, 2017）构建携带多个HLF表达盒的质粒（见补充材料）。为首先评估多拷贝整合对重组蛋白表达和分泌的影响，我们使用TurboGFP作为报告基因，与XPR2pre信号肽融合用于分泌，并构建含多个表达盒的质粒（图3a）。通过菌落PCR验证了多达四个TurboGFP表达盒的成功整合（见补充材料）。增加TurboGFP表达盒数量导致细胞内和细胞外荧光逐步升高
【数据】报告基因：TurboGFP；信号肽：XPR2pre；拷贝数：最多4拷贝；验证方法：菌落PCR；检测指标：细胞内和细胞外荧光
讨论与解读
本研究将解脂耶氏酵母开发为hLF分泌生产的平台底盘。通过信号肽筛选，鉴定出Lip2pre3xLA是hLF分泌的高效SP。值得注意的是，hLF的天然SP在解脂耶氏酵母中也保留了功能，凸显了异源SPs在该酵母宿主中的潜力。基于MS/MS的N端测序分析确认了Lip2pre3xLA的高效切割。然而，两个信号肽来源的残基（LA）保留在分泌的重组hLF的N端，需要进一步的生化与功能表征以及安全性评估，以确定重组hLF是否适用于特定的食品或制药应用。单纯增加HLF基因拷贝数会造成严重的细胞负担，表现为生长缺陷和丝状形态。相比之下，通过共表达分泌相关蛋白——特别是UPR调节因子HAC1p以及分子伴侣Pdi1p和Cne1p——来缓解这一瓶颈，有效增强了hLF的折叠和分泌能力，导致更高的胞外滴度。重要的是，基因拷贝数和分泌机器的协同优化被证明是必不可少的。在改变伴侣基因的调控元件以提高遗传稳定性后，优化菌株Yali-hLF-43在摇瓶中实现了409.9 mg/L的胞外hLF滴度，在5 L补料分批生物反应器中达到3143.6 mg/L。
编译者解读
该研究的方法论价值在于揭示了一个合成生物学中常被忽视的规律：基因拷贝数与分泌能力之间存在非线性关系。简单堆叠表达盒反而触发细胞负担，而共表达折叠与分泌辅助因子才是释放产量的关键。这一"表达-分泌平衡"策略对其他复杂糖蛋白的微生物制造具有借鉴意义。局限在于，信号肽切割后残留的LA二肽对hLF生物活性的影响尚未评估，且5 L发酵罐到工业规模的放大可行性仍需验证。
参考来源
期刊：Bioresource Technology, 2026
DOI: 10.1016/j.biortech.2026.135927
DOI: 10.1016/j.biortech.2026.135927