来源：Metabolic engineering of Saccharomyces cerevisiae for co-production of ergothioneine, salidroside and gadusol（Synthetic and Systems Biotechnology）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
麦角硫因、红景天苷和鳕鱼苷是三种高价值化妆品活性成分，分别具有抗氧化、抗炎和紫外线防护功能。本研究以GRAS级酿酒酵母为底盘，通过筛选异源EGT合成酶组合、融合增溶标签、结构导向稳定化突变、限速结构域工程化改造及rDNA多位点整合等策略，构建了一株可同时生产三种活性成分的酵母细胞工厂。最终在5-L生物反应器中实现1329 mg L⁻¹麦角硫因、224 mg L⁻¹红景天苷和556 mg L⁻¹鳕鱼苷的共生产。
研究背景
麦角硫因（EGT）是一种含硫组氨酸衍生物，具有强抗氧化活性，近年来被视为潜在的长寿相关微量营养素。红景天苷是红景天属植物的主要活性成分，因其抗炎和护肤特性被广泛用于功能性保健品和化妆品配方。鳕鱼苷是一种最初从鱼卵中发现的类菌胞素氨基酸化合物，作为内源性紫外线吸收剂，是环保可降解防晒霜和光防护化妆品的候选分子。这三种结构迥异的天然产物在食品、化妆品和制药领域应用广泛，市场需求持续增长。
传统生产方法——植物或动物提取以及化学合成——往往受限于产率低、成本高和环境污染。微生物生物合成利用可再生碳源，可实现绿色、高效、高选择性的目标生产，是有前景的可持续替代路径。目前，EGT、红景天苷和鳕鱼苷的单独生物合成途径均已在不同宿主中成功重建，但在单一菌株中实现三者的同时共生产尚未见报道。酿酒酵母作为GRAS生物，已广泛用于化妆品行业，是构建多功能细胞工厂的理想底盘。
研究方法
2.1 菌株与质粒
本研究中所有质粒列于补充表1。质粒在大肠杆菌JM109菌株中扩增。所有酿酒酵母菌株均衍生自CEN.PK2–1C（MATa; ura3-52, trp1-289, leu2-3_112, his3Δ1; MAL2-8c; SUC2）。这些菌株的详细信息见补充表2。基因编辑采用Cre/loxP重组系统进行。Cre/loxP介导的基因编辑所需的质粒pMHyLp-his、pMHyLp-trp、pMHyLp-leu和pY26-TEF1p-ura-Cre均来自实验室库存。所有整合到酵母中的外源基因由GENEWIZ（中国苏州）合成，并针对酿酒酵母的高效表达进行了密码子优化（补充表3）。
【数据】菌株：大肠杆菌JM109、酿酒酵母CEN.PK2–1C；质粒：pMHyLp-his、pMHyLp-trp、pMHyLp-leu、pY26-TEF1p-ura-Cre；基因合成公司：GENEWIZ（中国苏州）；其余参数原文未详述
2.2 试剂
本研究中所有引物由GENEWIZ（中国苏州）合成。DNA相关操作，包括纯化、凝胶回收和质粒提取，使用Sangon Biotech（中国上海）购买的试剂盒进行。使用TaKaRa（中国大连）的PrimeStar DNA聚合酶。PCR验证使用TaKaRa（中国大连）的Ex Taq® DNA聚合酶。此外，研究中使用的所有化学试剂均购自Sangon Biotech（中国上海）。
【数据】引物合成：GENEWIZ（中国苏州）；DNA聚合酶：PrimeStar DNA polymerase（TaKaRa，中国大连）、Ex Taq® DNA polymerase（TaKaRa，中国大连）；试剂盒及化学试剂：Sangon Biotech（中国上海）；其余参数原文未详述
2.3 培养基
本研究中，大肠杆菌菌株在含100 mg L⁻¹氨苄青霉素（Amp）的溶菌肉汤（LB）琼脂平板上进行筛选和培养。后续液体培养也在LB培养基（10 g L⁻¹胰蛋白胨、5 g L⁻¹酵母提取物和10 g L⁻¹ NaCl）中进行，并添加相同浓度的Amp。酵母感受态细胞在YPD培养基（20 g L⁻¹胰蛋白胨、10 g L⁻¹酵母提取物和20 g L⁻¹葡萄糖）中培养。携带pESC质粒的重组酵母菌株在添加200 mg L⁻¹遗传霉素（G418）的培养基中培养。固体培养时，YPD琼脂培养基通过添加15 g L⁻¹琼脂制备。营养缺陷型筛选使用合成缺陷型（SD）培养基，含3.4 g L⁻¹酵母氮源（YNB）、10 g L⁻¹硫酸铵和20 g L⁻¹葡萄糖，并添加所需氨基酸（组氨酸、亮氨酸、色氨酸和尿嘧啶），终浓度各为50 mg L⁻¹。为消除URA3标记质粒，YPD培养基中添加1 g L⁻¹ 5-氟乳清酸（5-FOA）。
【数据】Amp浓度：100 mg L⁻¹；LB培养基：10 g L⁻¹胰蛋白胨、5 g L⁻¹酵母提取物、10 g L⁻¹ NaCl；YPD培养基：20 g L⁻¹胰蛋白胨、10 g L⁻¹酵母提取物、20 g L⁻¹葡萄糖；G418浓度：200 mg L⁻¹；琼脂：15 g L⁻¹；SD培养基：3.4 g L⁻¹ YNB、10 g L⁻¹硫酸铵、20 g L⁻¹葡萄糖；氨基酸浓度：各50 mg L⁻¹；5-FOA浓度：1 g L⁻¹
2.4 质粒构建
使用两种质粒（pY26、pESC）构建基因表达盒。本研究中使用的所有相关引物列于补充表4。扩增时，以酿酒酵母基因组DNA为模板扩增所有天然元件，包括启动子、基因和终止子。密码子优化的Ncegt1、Cpegt1、Tregt1、Gfegt1、Ncegt2、Cpegt2、UGT、EEVS和MT-Ox基因由GENEWIZ（中国苏州）合成。相应的DNA序列见补充表3。启动子P GAL1和P GAL10从酿酒酵母基因组中扩增，载体骨架从质粒pESC中扩增。纯化的DNA片段使用Gibson Assembly组装到pESC载体中，构建含有异源基因表达盒的重组质粒。
【数据】质粒：pY26、pESC；合成基因：Ncegt1、Cpegt1、Tregt1、Gfegt1、Ncegt2、Cpegt2、UGT、EEVS、MT-Ox；启动子：P GAL1、P GAL10；组装方法：Gibson Assembly；基因合成公司：GENEWIZ（中国苏州）；其余参数原文未详述
2.5 菌株构建
我们采用整合型菌株工程策略，包括质粒转化、核糖体DNA（rDNA）多拷贝整合和Cre/loxP介导的基因组编辑，用于靶向基因过表达和敲除，遵循已有方法。首先，为实现异源基因表达，将亲本酿酒酵母菌株CEN.PK2–1C用着丝粒质粒转化。基础EGT生产菌株命名为E1，通过引入质粒pESC-NcTr构建，该质粒携带G418和Amp抗性，表达EGT合成酶基因Ncegt1和Tregt2。为增强酶活性，随后引入第二个着丝粒质粒pY26-1（TRP1标记）。为实现稳定高水平表达，将优化的合成酶基因表达盒通过Cre/loxP介导的同源重组整合到rDNA位点，获得具有改善遗传稳定性和产物滴度的多拷贝工程菌株。基因整合和标记回收使用Cre/loxP系统进行。将目标基因表达盒和侧翼带有loxP的选择标记克隆到具有约1000 bp同源臂的整合载体中。线性化载体通过醋酸锂法转化到酵母中，转化子在营养缺陷型平板上筛选。随机挑取阳性菌落进行摇瓶发酵。标记回收时，引入Cre表达质粒（pY26-TEF1p-ura-Cre）。Cre表达导致loxP位点之间的重组，切除标记。标记丢失在5-FOA平板上验证（针对URA3），Cre质粒通过连续传代消除，获得无标记工程菌株。
【数据】亲本菌株：CEN.PK2–1C；基础菌株：E1；质粒：pESC-NcTr（G418和Amp抗性）、pY26-1（TRP1标记）；整合位点：rDNA位点；同源臂长度：约1000 bp；转化方法：醋酸锂法；标记回收：pY26-TEF1p-ura-Cre、5-FOA平板验证；其余参数原文未详述
2.6 摇瓶培养
每个酵母菌落设三个生物学重复，在2 mL YPD中预培养，30 °C、220 rpm过夜培养。然后将预培养物以2%（v/v）接种到含50 mL YPD的250 mL锥形瓶中。培养24 h后，加入半乳糖至终浓度2%（w/v）以诱导目标基因表达。培养物在30 °C、220 rpm下持续培养96 h。
【数据】预培养体积：2 mL YPD；预培养条件：30°C、220 rpm、过夜；接种量：2%（v/v）；摇瓶规格：250 mL锥形瓶；装液量：50 mL YPD；诱导剂：半乳糖；诱导浓度：2%（w/v）；诱导时间点：培养24 h后；培养时间：96 h；温度：30°C；转速：220 rpm
2.7 5-L生物反应器补料分批发酵
从YPD琼脂平板挑取单菌落接种到5 mL YPD培养基中，30 °C、220 rpm过夜培养。然后将种子培养物以2%（v/v）接种到250 mL摇瓶中的50 mL YPD培养基中，在相同条件下培养12 h。将所得培养物接种到5-L生物反应器中，使初始OD600达到2。发酵在30 °C下进行，初始搅拌速度为300 rpm。pH通过自动添加氨水和30%磷酸维持在5.5。通气量维持在2 vvm，搅拌速度在300–1200 rpm范围内调节，以保持发酵系统中溶解氧水平约为30%。当发酵系统中初始碳源耗尽时，以12 mL h⁻¹的初始速率开始补料分批补料。补料溶液含600 g L⁻¹葡萄糖、60 g L⁻¹酵母提取物、1%（v/v）微量元素溶液和1.2%（v/v）维生素溶液。培养24 h后，加入半乳糖至终浓度2%（w/v）以诱导目标基因表达。同时，氨基酸溶液以5 mL h⁻¹的流速补充到发酵系统中。使用M-100生物传感器分析仪（Sieman Technology，中国）测定发酵上清液中葡萄糖和乙醇的浓度。微量元素溶液：每升含15 g EDTA、10.2 g ZnSO4·7H2O、0.5 g MnCl2·4H2O、0.5 g CuSO4、0.86 g CoCl2·6H2O、0.56 g Na2MoO4·2H2O、3.84 g CaCl2·2H2O和5.12 g FeSO4·7H2O。溶液在121 °C灭菌15 min，4 °C保存。维生素溶液：每升含1 g盐酸硫胺素（VB1）、1 g烟酸（VB3）、1 g泛酸钙（VB5）、1 g吡哆醇（VB6）、0.05 g生物素（VB7）、25 g肌醇（VB8）和0.2 g对氨基苯甲酸（PABA）。溶液经过滤除菌，4 °C保存。氨基酸溶液：每升含10 g组氨酸、10 g甲硫氨酸、10 g半胱氨酸。溶液经过滤除菌，4 °C保存。
【数据】种子培养：5 mL YPD、30°C、220 rpm、过夜；接种量：2%（v/v）；摇瓶培养：50 mL YPD、12 h；生物反应器：5-L；初始OD600：2；发酵温度：30°C；初始搅拌速度：300 rpm；pH：5.5（氨水和30%磷酸自动调节）；通气量：2 vvm；搅拌速度范围：300–1200 rpm；溶解氧：约30%；补料速率：12 mL h⁻¹；补料液：600 g L⁻¹葡萄糖、60 g L⁻¹酵母提取物、1%（v/v）微量元素、1.2%（v/v）维生素；诱导：培养24 h后加半乳糖至2%（w/v）；氨基酸补料速率：5 mL h⁻¹；微量元素溶液灭菌：121°C、15 min；其余参数原文未详述
2.8 十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析
为分析重组蛋白的表达，首先对酿酒酵母细胞进行细胞破碎。取1 mL发酵液，12,000 rpm离心收集细胞。所得沉淀用无菌水洗涤三次，重悬于等体积水中，然后使用玻璃珠（直径：0.5 mm）破碎。细胞破碎在自动样品快速研磨仪（上海净信，中国）中进行40个循环。
【数据】发酵液体积：1 mL；离心转速：12,000 rpm；洗涤次数：3次（无菌水）；玻璃珠直径：0.5 mm；破碎仪：自动样品快速研磨仪（上海净信，中国）；破碎循环：40个；其余参数原文未详述
研究结果
3.1 筛选和鉴定酿酒酵母中EGT生物合成的最佳EGT1/EGT2酶组合
真核生物中EGT的生物合成由两种必需酶催化：EGT1和EGT2。EGT1催化l-组氨酸甲基化生成组氨酸甜菜碱（HER），随后与半胱氨酸偶联形成组氨酸甜菜碱半胱氨酸亚砜（Cys-HER）。EGT2催化Cys-HER转化为2-(羟基硫烷基)组氨酸甜菜碱（图1A）。由于酿酒酵母缺乏内源性EGT生物合成能力，重建EGT途径需要异源表达功能性egt1和egt2基因。因此，我们系统评估了来自粗糙脉孢菌（Nc）、里氏木霉（Tr）、紫麦角菌（Cp）和灰树花（Gf）的EGT1和EGT2同源物（图1A，补充图1）。组合筛选结果表明，菌株E1表现出最佳性能（图1B），EGT总滴度达到34 mg L⁻¹（包括19 mg L⁻¹胞内和15 mg L⁻¹胞外）。EGT产量通过LC-MS进一步确认（图1C）。EGT合成酶筛选显示CpEGT1和GfEGT1无活性，而NcEGT1优于TrEGT1。在EGT2同源物中，TrEGT2和CpEGT2表现出较高活性。综合来看，这些结果表明存在宿主兼容性差异。最佳的NcEGT1-TrEGT2配对受益于代谢通道化，防止了中间体积累。本研究强调，优化宿主兼容性和酶间协调性是构建高效酵母途径的关键。
【数据】菌株：E1；EGT总滴度：34 mg L⁻¹（胞内19 mg L⁻¹，胞外15 mg L⁻¹）；酶组合：NcEGT1-TrEGT2为最佳；无活性酶：CpEGT1、GfEGT1；检测方法：LC-MS；其余参数原文未详述
3.2 改善NcEGT1可溶性表达增强EGT产量
尽管菌株E1能够生产EGT，但其滴度仍不理想。先前研究表明NcEGT1的表达可能是限制合成通量的主要瓶颈。为鉴定EGT生产中的关键限制因素，我们通过SDS-PAGE分析了NcEGT1和TrEGT2的表达水平。分析显示NcEGT1不溶性且表达水平低（图2A）。这些观察表明NcEGT1的差溶解性和低表达可能是限制EGT生物合成效率的关键瓶颈。为增强NcEGT1在酿酒酵母中的可溶性表达，我们评估了四种融合标签，包括硫氧还蛋白A（TrxA）、麦芽糖结合蛋白（MBP）、GST和N-利用物质蛋白A（NusA）。SDS-PAGE分析显示只有GST融合标签改善了NcEGT1的溶解性（图2B）。相应地，表达GST融合NcEGT1（GST-NcEGT1）的菌株E18产生了60 mg L⁻¹的EGT，达到无标签对照产量的1.8倍（图2C）。相比之下，NusA和MBP标签仅适度改善EGT产量，而TrxA标签未显示可检测的增强效果。这些结果表明GST融合促进了NcEGT1的可溶性表达，使酶在体内正确折叠和功能性表达，从而大幅提高EGT生物合成效率。随后，为进一步改善NcEGT1的稳定性和溶解性，使用ProteinMPNN-DDG算法进行了计算机辅助突变设计。选择了19个预测可能增强蛋白质稳定性的氨基酸残基进行定点突变（补充表5）。在构建的变体中，突变体E26（GST-NcEGT1A458P）的EGT产量比E18（GST-NcEGT1）增加了33%（图2D）。为进一步改善酶性能，将五个最有益的单突变位点（不包括A458P）分别与E26菌株中的A458P突变组合，生成一系列双突变体（图2E）。后续摇瓶发酵表明，菌株E43（GST-NcEGT1A458P/S745P）显示出比单突变体更高的EGT产量，EGT滴度达到89 mg L⁻¹（图2F）。我们推测A458P和S745P突变可能具有协同效应，通过共同改善NcEGT1的构象稳定性进一步提高其可溶性表达水平。上述研究表明NcEGT1的低溶解性是限制酵母中EGT生物合成效率的关键瓶颈。
【数据】菌株E18（GST-NcEGT1）EGT产量：60 mg L⁻¹（无标签对照的1.8倍）；突变体E26（GST-NcEGT1A458P）较E18提高：33%；菌株E43（GST-NcEGT1A458P/S745P）EGT滴度：89 mg L⁻¹；筛选突变位点数：19个；融合标签：TrxA、MBP、GST、NusA；有效标签：GST；算法：ProteinMPNN-DDG
3.3 通过鉴定和工程化NcEGT1的限速5-组氨酸半胱氨酸亚砜合成酶结构域增强EGT产量
NcEGT1是一种双功能酶，包含一个甲基转移酶结构域和一个5-组氨酸半胱氨酸亚砜合成酶结构域（图3A和B）。为鉴定EGT生物合成中的限速步骤，我们在E43菌株基础上分别过表达NcEGT1的甲基转移酶结构域片段（残基1-357，命名为TNC1）、NcEGT1的5-组氨酸半胱氨酸亚砜合成酶结构域片段（残基358-878，命名为TNC2）和TrEGT2（图3A）。EGT滴度分析显示，只有TNC2过表达增强了EGT产量，滴度达到106 mg L⁻¹，而TNC1和TrEGT2的过表达未改善EGT滴度（图3C）。这些结果表明TNC2催化的反应构成EGT生物合成途径的限速步骤。在先前研究中，Zhang等人报道TNC2中的特定突变（G2S/D109A、F478I、F478V和L447D）可以调节其酶活性。他们指出残基F478和L447位于催化口袋附近，表明这些位点可能作为关键功能残基。他们进一步将增强的酶活性归因于突变残基第2位丝氨酸和第109位丙氨酸之间的潜在相互作用。为研究这些突变，我们将相应的突变系统地引入TNC2。结果显示，只有突变体E50（TNC2G2S/D109A）显著增加了EGT产量，滴度达到132 mg L⁻¹，比E45菌株提高了25%（图3D，补充图2）。这些发现表明G2S/D109A突变通过改善TNC2催化效率增强EGT产量，进一步确认TNC2催化的步骤在EGT生物合成途径中是限速的。F478V、F478I和L447D突变未能进一步提高EGT滴度，可能归因于原核和真核系统在蛋白质折叠机制和胞内微环境方面的内在差异。总体而言，这些发现强调靶向缓解TNC2介导的限速步骤是增强EGT产量的关键。
【数据】结构域：TNC1（残基1-357）、TNC2（残基358-878）；TNC2过表达EGT滴度：106 mg L⁻¹；突变体E50（TNC2G2S/D109A）EGT滴度：132 mg L⁻¹（较E45提高25%）；无效突变：TNC1过表达、TrEGT2过表达、F478V、F478I、L447D；其余参数原文未详述
3.4 多拷贝途径整合实现酿酒酵母中稳定的EGT合成
基于菌株E50，我们原位恢复了URA3基因，并敲除了GAL1、GAL7和GAL10基因，分别编码半乳糖激酶、半乳糖-1-磷酸尿苷酰转移酶和UDP-葡萄糖-4-差向异构酶。敲除这些基因阻断了半乳糖代谢并增强了诱导效率，获得工程菌株E50-1。在补料分批发酵中，EGT滴度仍然较低，为115 mg L⁻¹（补充图3A），我们将其归因于双质粒系统的遗传不稳定性和抗生素依赖性。为克服这些限制并建立稳定高效的EGT合成平台，我们转向靶向rDNA位点的多拷贝染色体整合策略（图4A）。我们首先将GAL1/10启动子驱动的GST-Ncegt1 A458P/S745P和Tregt2表达盒（Gene 1）通过多拷贝整合到rDNA位点。从选择性平板上随机选取转化子进行发酵验证，获得菌株E68，EGT滴度达到50 mg L⁻¹（图4B）。然而，不同转化子之间EGT产量存在差异，部分菌株未检测到EGT。这种变异可能源于两个因素：rDNA位点的随机多拷贝整合导致拷贝数差异；同源重组过程中基因表达盒整合不完整，导致目标基因表达失败。
【数据】敲除基因：GAL1、GAL7、GAL10；菌株：E50-1；补料分批EGT滴度：115 mg L⁻¹；整合基因：GST-Ncegt1 A458P/S745P + Tregt2（Gene 1）；菌株E68 EGT滴度：50 mg L⁻¹；整合位点：rDNA位点；其余参数原文未详述
讨论与解读
本研究构建了一株能够同时生产EGT、红景天苷和鳕鱼苷的工程酿酒酵母菌株。多种EGT合成酶的筛选确定了NcEGT1和TrEGT2为最佳酶对。SDS-PAGE分析表明NcEGT1的差溶解性和低表达限制了EGT产量。为此，采用蛋白质工程策略——包括融合增溶标签、稳定化突变和结构域优化——增强NcEGT1的可溶性表达。进一步研究发现5-组氨酸半胱氨酸亚砜合成酶结构域催化的反应为限速步骤，过表达其工程化突变体TNC2G2S/D109A将EGT总滴度提高至132 mg L⁻¹，较亲本菌株E1提高了2.9倍。随后，将优化基因进行基因组多拷贝整合以提高遗传稳定性，在5-L生物反应器中实现690 mg L⁻¹的EGT产量。在此EGT底盘基础上，引入红景天苷和鳕鱼苷的异源途径。最终三产物共生产菌株实现1329 mg L⁻¹ EGT、224 mg L⁻¹红景天苷和556 mg L⁻¹鳕鱼苷的滴度。本研究在单一酵母菌株中建立了三种高价值天然产物的稳定共生产，证明了整合多途径工程的可行性，为高效生物合成提供了可规模化平台和可推广策略。
编译者解读： 该研究的核心策略是"先修瓶颈、再扩产能、后加支路"——先通过融合标签和理性设计解决NcEGT1可溶性瓶颈，再利用rDNA多拷贝整合替代质粒系统提升稳定性，最后在同一底盘上叠加红景天苷和鳕鱼苷途径。这一"模块化叠加"思路对合成生物学中多产物共生产具有参考价值。但需注意，三产物共生产可能面临前体竞争和代谢负担问题，文中虽未详细讨论，实际放大时乙酰辅酶A和芳香族氨基酸前体的分配平衡将是关键挑战。此外，rDNA整合的拷贝数异质性导致转化子间产量波动，筛选高产克隆仍是限速环节。
参考来源
期刊：Synthetic and Systems Biotechnology, 2026
DOI: 10.1016/j.synbio.2026.04.010
DOI: 10.1016/j.synbio.2026.04.010