来源：Development of surface plasmon resonance biosensor for rapid and reliable detection of snake venom protein in blood plasma（Optics and Lasers in Engineering）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
蛇咬伤在全球热带地区造成大量死亡和永久性残疾，但商业化蛇咬伤诊断试剂盒至今仍极为稀缺。本研究构建了基于表面等离子体共振（SPR）的生物传感器，利用硫醇与胺偶联化学将多价抗蛇毒血清固定在金膜表面，实现了对印度眼镜蛇（Naja naja）和印度罗素蝰蛇（Daboia russelii）粗毒的快速、无标记、选择性检测。传感器在缓冲液和血浆样本中均表现出高灵敏度与低检测限，响应时间约16–20分钟，为蛇咬伤床旁诊断提供了可行方案。
研究背景
蛇咬伤是一种被忽视的公共卫生问题，全球每年蛇咬伤报告超过540万例，其中180万–270万例发生中毒。南亚与东南亚、撒哈拉以南非洲以及中南美洲发病率最高。印度是全球蛇咬伤最严重的地区，每年报告约81,000例，农村地区尤为突出，致死人数约35,000–50,000人。印度次大陆分布有超过52种毒蛇，其中印度眼镜蛇（Naja naja）、罗素蝰蛇（Daboia russelii）、锯鳞蝰（Echis carinatus）和普通金环蛇（Bungarus caeruleus）被称为"四大毒蛇"，是当地绝大多数蛇咬伤事件的元凶。蛇毒中含有多种蛋白家族，病理生理机制复杂。例如，Naja naja中毒的临床特征包括上睑下垂、嗜睡、言语含糊、口吐泡沫、骨骼肌麻痹等。尽管现代检测技术不断发展，目前仅有一个商业化的蛇咬伤诊断试剂盒上市，远远无法满足有效治疗的需求。在此背景下，作者提出利用SPR生物传感器实现蛇毒蛋白的快速、无标记检测，并在缓冲液与血浆两种体系中验证其实际适用性。
研究方法
材料
Naja naja和Daboia russelii的冻干粗毒购自印度泰米尔纳德邦Mamallapuram的Irula Snake Catchers Industrial Co-operative Society。冻干多价抗蛇毒血清购自印度Telangana的VinsBioproducts Limited。1-乙基-3（3-二甲基氨基丙基）碳二亚胺（EDC）、N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）和11-巯基十一烷酸（MUA）购自MilliporeSigma（美国）。其余化学试剂均为分析纯，购自Merck Millipore或Sigma-Aldrich。
【数据】试剂：EDC、NHS、11-MUA； venom来源：Irula Snake Catchers Industrial Co-operative Society；抗蛇毒血清来源：VinsBioproducts Limited；其他试剂：Merck Millipore或Sigma-Aldrich；纯度：分析纯
方法
#### 样品制备
多价抗蛇毒血清：将冻干多价抗蛇毒血清用水复溶，并在pH 7.4的磷酸盐缓冲液（PBS）中透析24小时。随后使用Nanodrop 2000分光光度计（Thermo Scientific，美国）测定浓度，最终浓度调整为1000 ng/ml用于本研究的实验。
【数据】复溶溶剂：水；透析液：PBS；pH：7.4；透析时间：24h；浓度测定仪器：Nanodrop 2000；最终浓度：1000 ng/ml
蛇毒：在PBS中制备浓度范围为10–1000 ng/ml的不同浓度Naja naja和Daboia russelii粗毒溶液。蛇咬伤后出现临床症状时，血清或血浆中大多数蛇毒浓度>10 ng/ml，部分患者甚至超过100 ng/ml至1000 ng/ml。选择该浓度范围是为了模拟蛇咬伤后血浆中的蛇毒浓度。
【数据】蛇毒浓度范围：10–1000 ng/ml；溶剂：PBS；参考血浆浓度：>10 ng/ml，部分>100–1000 ng/ml
乏血小板血浆（PPP）：将新鲜山羊血收集于含3.8%柠檬酸三钠的试管中（血液:柠檬酸三钠=9:1）以制备血浆。柠檬酸化血液在900 g下离心20分钟后，吸取含PPP的淡黄色上清液并立即使用。
【数据】抗凝剂：3.8%柠檬酸三钠；血液与抗凝剂比例：9:1；离心力：900g；离心时间：20min；血浆类型：乏血小板血浆（PPP）；来源：新鲜山羊血
#### 传感器制备与SPR测量
在BK 7玻璃基板的一侧，先以射频磁控溅射沉积约5 nm的钛（Ti）粘附层（沉积速率=0.2 Å/sec），随后以直流磁控溅射沉积约50 nm的金（Au）层（沉积速率=0.5 Å/sec）（压力=6×10⁻⁶ mbar）。将Au包被的基板在5 mM 11-MUA乙醇溶液中孵育24小时以生成自组装单分子层（SAM），随后用乙醇和去离子水冲洗。将基板浸入400 mM EDC和100 mM NHS乙醇溶液的1:1混合物中1小时以进行SAM层表面活化。随后，将活化后的SAM层浸入多价抗蛇毒血清溶液中1小时进行固定，之后用1 M乙醇胺处理以封闭未反应的NHS酯，并用PBS清洗。此后，将不同浓度的粗蛇毒依次暴露于固定有抗蛇毒血清的Au包被基板，记录SPR光谱。图1a展示了SPR生物传感器的示意图。实验在定制的Kretschmann角度询问测量原型中进行，详细参数见我们此前发表的工作。SPR原型的示意图和实物照片分别见图1b和图1c。SPR装置的总体机械结构由尼龙材料在CNC车床上加工而成，以确保结构稳固。P偏振光（Edmund Optics，新加坡）通过玻璃棱镜以全内反射方式传播，利用可编程步进电机在不同入射角下激发传感区域的等离子体。反射光由微控制器控制的图像传感器（512像素，Hamamatsu Phonics，日本）收集以分析SPR光谱。
【数据】Ti层厚度：~5 nm；Ti沉积速率：0.2 Å/sec；Au层厚度：~50 nm；Au沉积速率：0.5 Å/sec；溅射压力：6×10⁻⁶ mbar；基板：BK 7玻璃；SAM试剂：5 mM 11-MUA乙醇溶液；SAM孵育时间：24h；活化试剂：400 mM EDC与100 mM NHS的1:1乙醇混合液；活化时间：1h；抗蛇毒血清固定时间：1h；封闭试剂：1 M乙醇胺；检测器：512像素图像传感器（Hamamatsu Phonics，日本）；棱镜类型：Kretschmann角度询问
研究结果
传感器表征
图2展示了生物传感器制备过程中每一步的紫外-可见（UV–Vis）吸收光谱。UV–Vis数据表明吸收峰发生连续红移，证实了11-MUA、EDC-NHS和多价抗蛇毒血清多层结构在Au基板上的成功堆叠。
【数据】表征手段：UV–Vis吸收光谱；现象：吸收峰连续红移；层叠组分：11-MUA、EDC-NHS、多价抗蛇毒血清
SPR响应
图3a展示了生物传感器制备过程中每一步后SPR共振角的变化。Au表面经11-MUA功能化、EDC-NHS表面活化以及多价抗蛇毒血清固定后，局部折射率（RI）增加，导致SPR共振位移。RI的变化源于SAM层的生长、SAM层末端基团经EDC-NHS连接化学转化为NHS活性酯，以及活化SAM层上固定的抗蛇毒血清。SAM层含有的硫醇基团与Au形成强共价键，对传感器表面配体的固定至关重要。因此，对SAM层的孵育时间进行了优化，如图3b所示。该图表明，孵育24小时的SAM层产生最大的共振位移，超过此时间后趋于饱和。因此，选择24小时孵育的SAM层作为表面活化的最终表面。SAM层经EDC-NHS活化的时间优化以及多价抗蛇毒血清在活化SAM表面固定的优化见补充图S1。
图3（c-d）展示了SPR共振角随暴露于传感器的Naja naja和Daboia russelii蛇毒浓度的变化。蛇毒抗原与抗蛇毒血清的结合在传感表面附近产生有效的RI增量，表现为SPR共振角的变化。由于抗蛇毒血清上活性结合位点的初始丰度，蛇毒蛋白与抗蛇毒血清之间发生强相互作用，导致传感器表面局部RI变化，在10–900 ng/ml浓度范围内SPR共振角随抗原浓度增加呈线性上升（R²=0.99）[图3（c-d）插图]。随后，随着结合动力学的进一步推进，活性结合位点逐渐减少，传感器响应在超过900 ng/ml后趋于饱和。SPR生物传感器的灵敏度和检测限（LoD）由图3（c-d）评估，列于补充表S1。SPR生物传感器的灵敏度表示为每单位蛇毒溶液浓度变化（μg/ml）对应的共振角位移（°）。LoD确定为三倍标准差与灵敏度之比。Naja naja和Daboia russelii的灵敏度分别为9.01678（°/µg/ml）和10.32268（°/µg/ml），LoD分别为9.37 ng/ml和9.89 ng/ml。两种蛇毒灵敏度和LoD的差异归因于其组成蛋白的差异。
表I展示了从SPR反射光谱中获得的SPR参数——半高全宽（FWHM）和共振深度——随粗蛇毒浓度的变化。该表表明，FWHM随Naja naja和Daboia russelii蛇毒浓度的增加而逐渐增大。对于Naja naja蛇毒，FWHM从10 ng/ml时的3.2608°增加到1000 ng/ml时的3.5682°；对于Daboia russelii蛇毒，在相同浓度范围内从3.4619°增加到3.7709°。SPR曲线的展宽可归因于较高蛇毒浓度下增强的抗原-抗体相互作用引起的等离子体阻尼增加和局部介电环境变化。类似地，共振深度也随蛇毒浓度增加而增大。对于Naja naja蛇毒，共振深度从0.2959变化至0.1578；对于Daboia russelii蛇毒，随蛇毒浓度从10 ng/ml增加到1000 ng/ml，共振深度从0.1487变化至0.0319。共振深度的增加表明在较高蛇毒浓度下，倏逝场与传感器表面生物分子结合的相互作用增强。
表II列举了一些基于广泛使用技术的粗蛇毒检测报道工作，表III基于样品制备步骤、总检测时间、标记需求、灵敏度、试剂体积、设备成本、操作复杂性和床旁检测（POCT）适用性对这些技术进行了多参数比较。从表II可以看出，本工作中SPR生物传感器的LoD与近期报道的基于不同技术的蛇毒检测工作相当。从表中还可以看出，一些基于ELISA、光学免疫分析、免疫荧光、电化学等技术的报道工作表现出比所制备的SPR生物传感器更好的LoD（pg/ml量级）。然而，与ELISA等酶基免疫分析相比，SPR方法消除了标记试剂和多次孵育/洗涤步骤的需求，将总检测时间从数小时显著缩短至约20分钟。此外，与基于侧向流免疫分析、免疫层析、比色法和电化学的免疫分析相比，SPR在不使用标记的情况下展现出极高的灵敏度。基于SPR的生物传感方法也非常适合POC诊断，因为它消除了免疫荧光分析中涉及的大量样品制备、多次操作步骤和标记标签等。与基于PCR的方法相比，SPR直接检测蛇毒蛋白，无需复杂的核酸提取和扩增，从而降低了操作复杂性并提高了快速临床诊断的适用性。因此，所提出的SPR方法克服了广泛报道技术的现有局限，适合POC诊断的目的，有望成功商业化蛇咬伤诊断试剂盒。
【数据】SAM层最优孵育时间：24h；线性范围：10–900 ng/ml；R²=0.99；Naja naja灵敏度：9.01678 °/µg/ml；Daboia russelii灵敏度：10.32268 °/µg/ml；Naja naja LoD：9.37 ng/ml；Daboia russelii LoD：9.89 ng/ml；Naja naja FWHM：3.2608°（10 ng/ml）→3.5682°（1000 ng/ml）；Daboia russelii FWHM：3.4619°→3.7709°；Naja naja共振深度：0.2959→0.1578；Daboia russelii共振深度：0.1487→0.0319；总检测时间：~20 min
结合动力学
SPR生物传感器的响应时间是注射抗原溶液后SPR共振角稳定所需的时间。图4展示了SPR传感图，显示了不同剂量Naja naja蛇毒与抗蛇毒血清的结合动力学，包括结合阶段（注入蛇毒抗原）和解离阶段（用PBS替换蛇毒抗原）。从图中可以观察到，随着每一剂量蛇毒溶液的引入，SPR共振角由于蛇毒蛋白与抗蛇毒血清的结合而缓慢上升至稳态值，约在16–17分钟内饱和。随后，将PBS注入传感器表面，代表解离阶段，在此期间自然解离的蛇毒抗原部分从抗蛇毒血清上脱落，导致共振角部分返回初始值。此后，使用低pH甘氨酸缓冲液（pH~2.5）以实现结合蛇毒抗原从抗蛇毒血清上的完全去除，使共振角几乎恢复到初始位置。
图5展示了SPR传感图，描绘了不同浓度Daboia russelii蛇毒溶液与抗蛇毒血清的结合动力学，包括结合阶段和解离阶段。与Naja naja蛇毒类似，随着每一浓度Daboia russelii蛇毒溶液的引入，蛇毒抗原与抗蛇毒血清的结合导致共振角逐渐增加，约20分钟后达到稳态。随后，自然未结合蛇毒的解离……（原文此处截断）
【数据】Naja naja响应时间：~16–17 min；Daboia russelii响应时间：~20 min；解离液：PBS；再生液：低pH甘氨酸缓冲液（pH~2.5）
重复性、重现性与选择性
图6（a-b）分别展示了SPR生物传感器检测Naja naja和Daboia russelii蛇毒的重复性，图6（c-d）展示了重现性。
图7（a）展示了对照实验，以确定固定化抗蛇毒血清的有效性和其他层的非特异性。图7（b）展示了SPR生物传感器对BSA、H-IgG、Naja naja蛇毒和Daboia russelii蛇毒的选择性响应。
【数据】选择性测试蛋白：BSA、H-IgG、Naja naja蛇毒、Daboia russelii蛇毒；对照实验目的：验证固定化抗蛇毒血清有效性及其他层非特异性
血浆样本检测
图8展示了SPR对血浆样本中不同稀释度粗蛇毒的响应：（a）Naja naja和（b）Daboia russelii。
【数据】检测基质：血浆样本；检测对象：Naja naja和Daboia russelii粗蛇毒不同稀释度
讨论与解读
本研究通过硫醇和胺偶联化学在金包被基板上固定多价抗蛇毒血清，构建了SPR生物传感器，在定制的等离子体原型上完成了对Naja naja和Daboia russelii粗毒的快速、无标记检测。对照实验证实了SAM层和活化SAM层在传感器制备中的有效性，排除了抗蛇毒血清直接粘附的干扰。传感器具有宽线性范围（10–900 ng/ml，R²=0.99）、高灵敏度（9.01678和10.32268 °/µg/ml）、低检测限（9.37和9.89 ng/ml），响应时间约16–20分钟，重复性、重现性和稳定性良好。传感器对BSA和H-IgG等干扰蛋白响应可忽略，表现出对粗蛇毒的选择性。血浆样本中的满意响应验证了实际应用可行性。作者指出，未来可将SPR生物传感器阵列集成到单一多重检测平台中。
编译者解读：该研究在方法层面选择了成熟的硫醇-胺偶联化学与Kretschmann角度询问SPR架构，技术路线稳健但并非全新。其真正价值在于将SPR检测从缓冲液推进到血浆基质，并系统比较了与ELISA、LFA、PCR等技术在POCT适用性上的差异——无标记、~20分钟、无需核酸提取，这些特征直击蛇咬伤诊断的时效痛点。局限在于：仅针对两种蛇毒验证，未覆盖"四大毒蛇"中的锯鳞蝰和金环蛇；抗蛇毒血清作为识别元件虽具广谱性，但批次间差异可能影响重现性；血浆中蛇毒浓度动态范围大，900 ng/ml以上的饱和区可能遗漏高浓度样本。若能将传感器阵列化并纳入更多蛇种，其商业化前景值得期待。
参考来源
期刊：Optics and Lasers in Engineering, 2026
DOI: 10.1016/j.optlaseng.2026.109948
DOI: 10.1016/j.optlaseng.2026.109948