基于生存压力介导分子内同源重组的毕赤酵母高效无痕基因编辑

📅 2026-09-22 📰 Microbiological Research 2027-01-31 📂 研究进展 👁 36

来源：Efficient scarless gene editing in Pichia pastoris via survival stress-based intramolecular homologous recombination（Microbiological Research）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription

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导读

毕赤酵母是重组蛋白生产的重要宿主，但现有基因编辑工具依赖外源核酸酶或重组酶，存在脱靶风险与基因组不稳定等问题。本研究开发了一套基于pop-in/pop-out策略的无痕编辑系统，利用双MazF反向筛选与生存压力驱动的分子内同源重组，无需Cas9等可编程核酸酶即可实现高效基因敲除与敲入。在测试案例中，基因敲除效率接近100%，整合效率超过86.67%，为毕赤酵母合成生物学提供了新的编辑工具。

研究背景

微生物菌株工程是现代生物技术的基石。传统诱变筛选技术（如紫外照射、化学诱变、常压室温等离子体诱变）在提升微生物产物滴度方面取得了显著进展，但其随机突变本质、基因组背景不清晰以及筛选效率低下等问题，严重制约了微生物表型的进一步优化。经验性筛选策略正逐渐被精准分子改造技术所补充——后者依赖多组学技术、基因组尺度代谢模型和模块化基因工程策略，能够实现系统代谢重塑，提高产物产量、减少副产物积累、拓宽底物利用谱，并将菌株优化周期从数年缩短至数月。

精准基因组操作高度依赖基因编辑技术，这些技术如同“分子手术刀”，可实现靶向基因敲除、整合和调控。然而，当前编辑方法仍面临效率低和/或DNA切割引发基因组不稳定等挑战。为此，本研究开发了一种新型pop-in/pop-out编辑系统，通过巧妙的元件排布，使宿主基因组在特定生存压力下仅发生预期类型的DNA重组，从而简化筛选。该系统不依赖外源重组酶或Cas9等可编程核酸酶，避免了核酸酶诱导的双链断裂及相关脱靶突变或染色质疲劳，同时保持高编辑效率且不改变宿主固有遗传特性。相较于位点特异性重组方法，其双MazF反向筛选可实现无痕编辑，避免疤痕序列引起的基因组不稳定。

研究方法

2.1 菌株、质粒与培养条件

本研究所用毕赤酵母菌株和质粒见表S1。基因编辑宿主菌为毕赤酵母GS115（组氨酸营养缺陷型），购自Thermo Fisher Scientific（中国）有限公司（上海）。大肠杆菌TOP10F′（上海唯地生物技术有限公司）用于质粒构建与扩增。所有酵母在28 ℃培养，所有大肠杆菌在37 ℃培养。Phanta Max Master Mix和Rapid Taq Master Mix（南京诺唯赞生物科技股份有限公司）分别用于质粒构建和菌落PCR验证。限制性内切酶购自Takara（宝日医生物技术（北京）有限公司）和Thermo Fisher Scientific（中国）有限公司（上海）。

pAOXLMz的构建：以pPICZA-mazf（Jiao et al., 2019b）为模板载体，使用引物MCSpAOX1-F和MCSTT-F扩增mazF基因表达盒，用BamH I酶切。pPICZA-mazf用Bgl II和BamH I双酶切，回收含BleoR基因表达盒的线性载体骨架。两个酶切产物用DNA Ligation Kit （宝日医生物技术（北京）有限公司）连接，转化大肠杆菌TOP10F′感受态细胞。转化子涂布于含25 μg/mL Zeocin的LLB固体培养基（胰蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L，NaCl 5 g/L，pH 7.5），用引物MCSpAOX1-F和MCSTT-F进行菌落PCR验证。序列正确且mazF基因表达盒方向保持正确的克隆命名为pPICZA-mazf (MCS)。

以毕赤酵母GS115基因组为模板，用引物pLra3-F1/pLra3-R1克隆P LRA3。从pPICZA-mazf质粒中用引物lacOmz-F1和AoxTT-R1扩增mazF和AOX1终止子片段。同时，pPICZA-mazf (MCS)质粒用Nde I和Kpn I酶切线性化并回收。线性载体骨架与其他片段以1:2摩尔比混合，使用pEASY®-Pro Seamless Cloning and Assembly Kit（北京全式金生物技术有限公司）在50 ℃下Infusion克隆连接30 min。混合物转化大肠杆菌TOP10F'感受态细胞。转化子涂布于含25 μg/mL Zeocin的LLB平板，用引物pLra3-F1和pLra3-R1进行菌落PCR验证。序列正确的克隆命名为pAOXLMz。

【数据】菌株：毕赤酵母GS115、大肠杆菌TOP10F′；培养基：LLB（胰蛋白胨10 g/L、酵母提取物5 g/L、NaCl 5 g/L、pH 7.5）；抗生素：25 μg/mL Zeocin；酵母培养温度：28 ℃；大肠杆菌培养温度：37 ℃；连接温度/时间：50 ℃/30 min；摩尔比：1:2

pAOXLMz-KO（KO代表待敲除的靶序列）的后续构建：以毕赤酵母GS115基因组为模板，用引物对（见表S2）PCR扩增靶基因座的相关正向重复序列（DRs），包括上游同源臂（UPHA）、下游同源臂（DWHA）和CDS 3′同源臂（3′HA）。同时，pAOXLMz载体用Nde I和Kpn I酶切线性化，纯化回收P LRA3启动子调控的mazF表达盒片段（Mz）。载体骨架（VB）用Bgl II和Bln I酶切后回收。VB与其他片段以1:2摩尔比混合，50 ℃下Infusion克隆连接30 min，片段VB、UPHA、DWHA、Mz和3′HA融合形成完整质粒。混合物转化大肠杆菌TOP10F′感受态细胞。转化子涂布于含25 μg/mL Zeocin的LLB固体培养基，序列正确的菌落命名为pAOXLMz-KO。

【数据】菌株：大肠杆菌TOP10F′；培养基：LLB固体培养基；抗生素：25 μg/mL Zeocin；连接温度/时间：50 ℃/30 min；摩尔比：1:2；酶切位点：Nde I、Kpn I、Bgl II、Bln I

pAOXLMz-Vps13⸬EGFP的构建：从GS115基因组中扩增Vps13-UPHA和Vps13-DWHA，方法同前。同时，从GS115基因组、EGFP质粒（未发表数据）和pAOXLMz中分别扩增GAP启动子、egfp编码序列和CYC1终止子。随后，pAOXLMz用Bgl II和Kpn I酶切，与Vps13-UPHA通过Infusion克隆连接，生成质粒pAOXLMz-Vps13⸬EGFP-mid。接着，通过SOE PCR将UPHA、GAP启动子、egfp编码序列、CYC1终止子和Vps13-DWHA连接形成插入片段。该片段与经Bln I和Nde I酶切的pAOXLMz-Vps13⸬EGFP-mid通过Infusion克隆连接。序列正确的菌落命名为pAOXLMz-Vps13⸬EGFP。

质粒pCreLMz-Vps13⸬EGFP分为两段，通过TA克隆与pMD19-T连接。分别从pAOXLMz-Vps13⸬EGFP中扩增egfp表达盒和“Vps13-UPHA”–Mz–“Vps13-DWHA”，随后通过SOE PCR连接。加A尾后，该构建体（含lox66和lox71）使用TaKaRa DNA Ligation Kit LONG（宝日医生物技术（北京）有限公司）与pMD19-T连接，转化大肠杆菌TOP10F′感受态细胞。转化子涂布于含50 μg/mL氨苄青霉素的LB固体培养基，序列正确的菌落命名为pGMZ。后续质粒pCreBleoR含Ori-BleoR表达盒和Cre表达盒（Cre编码序列从pUAxp7166（Jiao et al., 2023）扩增，Ori-BleoR表达盒和AOX1启动子/终止子从pAOXLMz扩增）。这些组件通过SOE PCR连接，加A尾后与pMD19-T连接。两个质粒用Sfi I（不同切割序列）酶切，使用TaKaRa DNA Ligation Kit LONG连接，形成新质粒pCreLMz-Vps13⸬EGFP。

【数据】菌株：大肠杆菌TOP10F′；培养基：LB固体培养基；抗生素：50 μg/mL氨苄青霉素；酶切位点：Bgl II、Kpn I、Bln I、Nde I、Sfi I；启动子：GAP、AOX1、P LRA3；终止子：CYC1、AOX1 TT

2.2 电转化与敲除/敲入流程

电转化方法同先前描述（Jiao et al., 2018a）。所有质粒在电转化前用特定限制酶（见表1）酶切线性化，转化子涂布于含100 μg/mL Zeocin的YPDS固体培养基（胰蛋白胨20 g/L，酵母提取物10 g/L，葡萄糖20 g/L，山梨醇1 M）（对于pAOXLMz-Ade1dw500、pAOXLMz-Ade1dw250、pAOXLMz-Ade1dw100和pAOXLMz-Ade1dw35，额外补充1 g/L腺嘌呤）。菌落用Lysis Buffer for Microorganism to Direct PCR（宝日医生物技术（北京）有限公司）裂解，裂解液用于PCR验证。所有用于PCR验证的菌落均为随机挑取。所有效率基于至少3个生物学重复计算。

验证正确的转化子转移至MRH培养基（Jiao et al.描述）进行诱导培养（约1–1.5天），随后将消除了P LRA3调控的mazF表达盒的克隆转移至MMH培养基（Jiao et al.描述）进行诱导培养（约2.5–4天），消除了P AOX1启动子调控的mazF表达盒的克隆即为成功无痕敲除靶基因的菌株。对于连续诱导过程，细胞在MRH培养基中培养1–1.5天，离心收集后用无菌水重悬两次，随后转移至MMH培养基培养2.5–4天；对于敲除难度极高或片段序列较大的基因，诱导期可延长至5–7天。

【数据】培养基：YPDS（胰蛋白胨20 g/L、酵母提取物10 g/L、葡萄糖20 g/L、山梨醇1 M）、MRH、MMH；抗生素：100 μg/mL Zeocin；腺嘌呤补充：1 g/L（特定质粒）；诱导培养时间：MRH 1–1.5天，MMH 2.5–4天（可延长至5–7天）；生物学重复：至少3个

2.3 显微镜观察

EGFP表达通过激光共聚焦显微镜（Olympus FV3000，奥林巴斯株式会社，日本）检测，激发波长488 nm，检测波长500–600 nm。

【数据】仪器：Olympus FV3000激光共聚焦显微镜；激发波长：488 nm；检测波长：500–600 nm

研究结果

3.1 3′同源区作为整合位点与PTVA现象

首先，在毕赤酵母GS115中分别通过pAOXLMz-ku70和pAOXLMz-Ade1测试了两个重要基因ku70（CDS为1863 bp）和Ade1（CDS为915 bp）的敲除。整个敲除过程的原理如图1所示，涉及将质粒在3′同源区线性化，通过单交换整合到GS115基因组中。由于整合质粒长度较大，用单对引物扩增验证极为困难。因此，使用两对引物分别通过菌落PCR验证跨越上游区域（SUR）和跨越下游区域（SDR）（图1）。

▲ Knockout process: the target 3′ homologous region serves as the integration site. This figure illustrates the genotypic alterations during the knockout process. “Primer OutF/R” bind to genomic sequences outside the integrated plasmid, whereas “Primers inF/R” bind to regions within the integrated pla

在Ade1敲除过程中，首先用pLra3-inF/pAde1out-R验证SDR，奇怪的是未检测到目标扩增产物，而SUR中可检测到目标扩增产物（图S1-A）。初步调查聚焦于潜在技术因素，包括菌落裂解液扩增效率和一般实验误差。随后关注到一个特定假设：P LRA3启动子的基础活性可能导致MazF蛋白产生，从而在下游同源位点引起提前重组。为验证此假设，随机选取一个菌落提取基因组DNA，以提取的DNA为模板，使用引物对pLra3-inF/pAde1out-R和ori-inF/pAde1out-R进行SDR验证PCR。有趣的是，未出现预期结果——与之前结果相同，pLra3-inF/pAde1out-R未扩增出PCR产物，而ori-inF/pAde1out-R扩增的PCR产物比预期的1.259 kb更长，约为2 kb。这一意外结果引起了注意，随后基于转化子在YPDS培养基筛选过程中生长缓慢的现象，推测有两个因素可能促成了PTVA（转化后载体扩增）现象的发生（Jiao et al., 2018b）。无腺嘌呤的YPDS培养基可能导致腺嘌呤供应不足和生存压力，而质粒插入靶基因3′同源区可能破坏了正常终止序列，导致Ade1 mRNA通读转录，在生存压力下ADH1蛋白过表达，这也可能影响细胞生长，导致PTVA现象的发生。

【数据】基因：ku70（CDS 1863 bp）、Ade1（CDS 915 bp）；引物对：pLra3-inF/pAde1out-R、ori-inF/pAde1out-R；预期PCR长度：1.259 kb；实际PCR长度：约2 kb；培养基：YPDS

基于先前提出的理论模型（Jiao et al., 2018b），推测了PTVA形成的遗传结构，并鉴定了一对可选择性扩增该结构内PCR产物的引物（ori-inF/pAOX1-inR）（图2）。通过对先前实验中13个克隆进行菌落PCR验证，确认所有菌株均表现出预期的PTVA现象（图2，图S1-B-III）。

▲ The effect of PTVA on pop-out events - genotypic alterations. I: LRA3MazF Cassette was lost by the recombination of target “dw” DRs When expression of the target gene is suppressed, survival pressure is induced, triggering the PTVA phenomenon between the two target “up” DRs containing the target-gen

当P LRA3调控的mazF表达后，它以两种不同方式发生重组（图2）。如果重组发生在基因的3′同源区内（图2-II），则重新形成功能完整的Ade1表达盒，从而缓解腺嘌呤生存压力。引物对ori-inF/pAde1out-R的理论PCR扩增长度为2.168 kb（图2-II），与先前实验结果一致（图S1-B-III），从另一角度进一步证实了PTVA的存在。然而，从另一角度看，这种重组最终仅恢复野生型基因型，并非我们所期望的基因结构。因此，从重复实验中额外随机选取19个转化子，鉴定出通过下游同源区发生重组的菌株（7/19）（图2-I，图S1-B-II）。这些菌株随后接种到MMHA培养基（MMH加500–1000 mg/L腺嘌呤）中。还鉴定出一株未发生重组的菌株（1#，3759 bp）（1/19）。甲醇诱导3天后，将酵母悬液划线于YPDA固体培养基。随机选取16个菌落进行PCR检测，所有选取菌株均缺失Ade1基因。后续测序证实Ade1基因CDS区域被精确准确切除（图S1-C）。

【数据】引物对：ori-inF/pAOX1-inR、ori-inF/pAde1out-R；理论PCR长度：2.168 kb；鉴定菌株：7/19通过下游同源区重组；未重组菌株：1/19（1#，3759 bp）；MMHA腺嘌呤浓度：500–1000 mg/L；甲醇诱导时间：3天；PCR检测菌落数：16个

在整个Ade1敲除过程中，质粒单交换整合效率达到58.14%（25/43），虽然总体敲除率仅达到27.91%（12/43 × 16/16），但甲醇诱导反筛选效率高达100.00%（16/16），Sanger测序结果证明Ade1的915 bp CDS被完全消除（图S1-D）。另一方面，来自MMHA的所有菌落在YPD平板上均呈现特征性红褐色色素沉着（图S1-G, H），表明Ade1基因成功被破坏，证实了甲醇诱导的高效率。

【数据】单交换整合效率：58.14%（25/43）；总体敲除率：27.91%（12/43 × 16/16）；甲醇诱导反筛选效率：100.00%（16/16）；Ade1 CDS长度：915 bp；表型：红褐色色素沉着

在ku70敲除过程中，类似地，pAOXLMz-ku70高效（100.00%，24/24）整合到基因组的指定位置（图S2-A&B）。从菌落PCR验证可以看出，50.00%（12/24）的转化子显示意外结果，但与PTVA结构的预期结果一致（图S2-B）。因此，再次验证24个转化子是否表现出PTVA现象，结果显示所有转化子均被证实表现出PTVA现象（图2-I，图S2-C）。与之前结果相同，甲醇诱导3天后随机选取20个菌落进行PCR检测，所有选取菌株均缺失ku70基因（图S2-C）。在整个ku70敲除过程中，质粒单交换整合效率达到100.00%（24/24），虽然总体敲除率仅达到29.17%（7/24 × 20/20），但甲醇诱导反筛选效率高达100.00%（20/20），Sanger测序结果证明ku70的1863 bp CDS被完全消除（图S2-E）。

【数据】单交换整合效率：100.00%（24/24）；意外结果转化子：50.00%（12/24）；总体敲除率：29.17%（7/24 × 20/20）；甲醇诱导反筛选效率：100.00%（20/20）；ku70 CDS长度：1863 bp；甲醇诱导时间：3天；PCR检测菌落数：20个

3.2 下游同源区作为整合位点提高基因编辑效率

基于先前实验结果，总体敲除率低显然受到PTVA影响。为避免这种情况，将单交换整合位点从3′同源区转移到下游同源区。同时，将pAOXLMz-ku70改造为pAOXLMz-ku70dw，延长下游同源片段以促进质粒线性化。具体原理如图3所示。不出所料，单交换整合效率显著（80.95%，17/21）。P LRA3的泄漏表达普遍存在，所有转化子均显示3′同源区重组，经菌落PCR验证确认（图3，图S3-A-I）。

▲ Knockout process: the target downstream homologous region serves as the integration site. This figure illustrates the genotypic alterations during the knockout process. For site-specific integration at the downstream homologous region, pAOXLMz-KO is linearized at the unique restriction site within t

为解决此问题，测试了不同天数甲醇诱导反筛选的效率。如图S3-B所示，第2.5天培养基变微浊时，敲除率已显著（77.43%，17/21 × 22/23）。到第3.5天，总体敲除率达到80.95%（17/21 × 23/23），汇总重复实验后，平均总体敲除率为90.87% ± 9.55%。此外，还测试了MMH固体培养基上的反筛选效率。选取新鲜菌落（培养2.5天）进行PCR验证，结果显示敲除率可观，为63.35%（17/21 × 18/23），平均总体敲除率为84.70% ± 11.76%。进一步在GS115ΔAde1中敲除ku70，以评估连续敲除对敲除效率的影响。结果（图S3-C）表明无显著影响。

【数据】单交换整合效率：80.95%（17/21）；第2.5天敲除率：77.43%（17/21 × 22/23）；第3.5天总体敲除率：80.95%（17/21 × 23/23）；平均总体敲除率：90.87% ± 9.55%；MMH固体培养基第2.5天敲除率：63.35%（17/21 × 18/23）；平均总体敲除率：84.70% ± 11.76%

3.3 下游同源区作为整合位点的敲入过程

敲入过程采用与敲除相似的设计，但整合位点位于靶基因下游同源区。无缝敲入载体pAOXLMz-IN与敲除载体pAOXLMz-KO的区别在于：前者在靶“up”和“dw”DRs之间插入了额外的敲入序列“Cassette”，而其“3′HA”被替换为“dw”DR（图4）。

▲ Knockin process: the target downstream homologous region serves as the integration site. The seamless knockin vector pAOXLMz-IN differs from the knockout vector pAOXLMz-KO in that an additional knock-in sequence “Cassette” is inserted between the target “up” and “dw” DRs in the former, while its “3′

为验证该系统在敲入中的应用，将EGFP表达盒整合到Vps13位点。如图5所示，由组成型GAP启动子驱动的EGFP表达盒整合到GS115ΔVps13的Vps13基因座，共聚焦激光扫描显微镜确认了强绿色荧光蛋白信号。

▲ EGFP was integrated into the designated site. A: Result of plasmid pAOXLMz-Vps13⸬EGFP, the EGFP expression cassette driven by the constitutive GAP promoter was integrated into the Vps13 locus of GS115ΔVps13, and confocal laser scanning microscopy confirmed strong green fluorescent protein signals in

通过pAOXLMz-Vps13⸬EGFP和pCreLMz-Vps13⸬EGFP两种质粒进行敲入。对于pAOXLMz-Vps13⸬EGFP，单交换整合效率为86.67%（13/15），甲醇诱导反筛选后，敲入效率达到86.67%（13/15）。对于pCreLMz-Vps13⸬EGFP，采用Cre/loxP系统切除标记基因，敲入效率为80.00%（12/15）。两种方法均成功实现EGFP在Vps13位点的无痕整合。

【数据】质粒：pAOXLMz-Vps13⸬EGFP、pCreLMz-Vps13⸬EGFP；单交换整合效率：86.67%（13/15）；敲入效率：86.67%（13/15）（pAOXLMz-Vps13⸬EGFP）；敲入效率：80.00%（12/15）（pCreLMz-Vps13⸬EGFP）；靶位点：Vps13；报告基因：EGFP；启动子：GAP

▲ Knockin process of plasmid pCreLMz. The markerless knockin vector pCreLMz-IN consists of the knockin sequence (Cassette), the upstream homologous fragment (“up”) and downstream homologous fragment (“dw”) of the target locus, the “LRA3MazF”, the Zeocin resistance gene (BleoR), the E. coli replication

讨论与解读

毕赤酵母因其优异的外源蛋白表达能力，已成为制药和工业生产中的重要宿主酵母。对该生物进行遗传改造的必要性毋庸置疑，尤其是关键基因的编辑，需要高效稳定的基因编辑工具。本研究开发了一种基于pop-in/pop-out的反筛选方法，利用巧妙的元件排布，使宿主基因组严格按预设生存压力进行重组。该方法可实现高效稳定的无痕基因敲除和敲入，通过单同源交换整合策略最终达到同源双交换重组的效果。从结果导向看，该方法可视为有效增强同源双交换事件的手段。与传统pop-in/pop-out方法相比，本方法效率更高，且能稳定敲除具有重要生理功能的基因。与常规CRISPR-Cas系统不同，本方法无脱靶风险、无需额外重组酶、不改变宿主遗传特性，避免了DNA损伤响应及后续染色质疲劳，同时保持高效率。

编译者解读：该研究巧妙利用MazF毒素的反向筛选压力，将“筛选”与“重组”耦合——只有发生正确重组事件的细胞才能存活，从而大幅简化筛选流程。其最大优势在于不依赖外源核酸酶，规避了CRISPR系统的脱靶与染色质疲劳问题，且双MazF设计实现了无痕编辑。局限在于单交换整合效率仍是整体编辑效率的瓶颈，且PTVA现象在3′同源区整合时难以完全避免。对于合成生物学中需要多位点、大片段无痕改造的应用场景，该系统提供了有价值的替代方案，但通量与多重编辑能力仍有待拓展。

参考来源

期刊：Microbiological Research, 2027

DOI: 10.1016/j.micres.2026.128736

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