来源：Cas9-PALB2 fusion protein enhances CRISPR/Cas9 mediated gene knock-in efficiency（Journal of Bioscience and Bioengineering）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
CRISPR/Cas9介导的同源定向修复（HDR）可实现精准基因组编辑，但其敲入（KI）效率低下一直是核心瓶颈。本研究将DNA修复因子PALB2与Cas9融合表达，在HEK293T细胞中将KI效率提升约1.7倍，并展现出跨细胞类型的适用性。进一步联合小分子Nocodazole处理，KI效率可达25.5%。该策略为高保真基因组编辑需求提供了高效、通用的解决方案。
研究背景
过去十年间，基于CRISPR的技术彻底改变了基因组操控能力，重塑了功能基因组学研究的格局。在CRISPR工具箱中，CRISPR/Cas9介导的HDR能够实现预设突变的精准基因组编辑，是基因功能分析、疾病模型构建及基因治疗策略开发不可或缺的工具。然而，尽管CRISPR/Cas9在介导基因敲除方面效率强劲，依赖HDR的基因KI因其固有低效率仍是主要瓶颈。此前研究者探索了sgRNA设计、供体修饰、同源臂长度优化等策略，虽在一定程度上提升了KI效率，但存在局限性——优化CRISPR系统组件往往需要精确调整多个参数，且不同细胞类型和基因位点的需求各异，难以找到普适的最优组合。从细胞损伤修复过程出发、利用其天然修复机制，则可更精准地整合基因KI，减少错误突变，更符合正常生理状态。近期研究聚焦于通过激活或过表达HDR相关因子来提高KI效率。在此背景下，本研究报道了PALB2与CRISPR/Cas9核酸酶共表达可触发增强的HDR效应。
研究方法
PALB2修饰的CRISPR/Cas9系统构建
eSpCas9(1.1)质粒（编号71814）购自Addgene（美国马萨诸塞州沃特敦）。Cas9-PALB2质粒由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。人PALB2参考序列取自NCBI GenBank（登录号NM_024675.4）。为消除异质性转染效率对HDR定量的混杂影响，本研究将mCherry阳性率确立为归一化指标，并通过T2A序列将mCherry融合至Cas9-PALB2，从而实现对基因组编辑效率的精确校准。为探究PALB2对CRISPR/Cas9系统工作性能的影响，采用了名为SLEEK的基因KI技术（文献30）。目标DNA片段通过HDR插入必需基因的最后一个外显子，同时保持必需氨基酸的完整功能。
【数据】质粒：eSpCas9(1.1)（Addgene编号71814）；PALB2参考序列：NCBI GenBank NM_024675.4；归一化指标：mCherry阳性率；融合方式：T2A序列连接mCherry；KI技术：SLEEK
细胞培养与传代
HEK293T和HeLa细胞维持于高糖DMEM培养基中，补充10%胎牛血清（FBS）和1%青霉素-链霉素。人骨骼肌细胞（HSkMCs）培养于含10% FBS、1%青霉素-链霉素和1% L-谷氨酰胺的高糖DMEM中。传代时，待细胞达到70–90%汇合度即进行消化。简要操作如下：吸去原培养基，沿培养皿边缘轻轻加入1 mL磷酸盐缓冲液（PBS）以冲洗细胞代谢碎片。去除PBS后，用0.25%胰蛋白酶-EDTA在37 °C下消化1–3 min。当倒置显微镜下细胞边缘呈现明亮圆润时，立即加入含血清培养基终止消化，轻轻吹打形成单细胞悬液。将细胞悬液转移至离心管，以1000 rpm离心3 min。弃去上清，将沉淀重悬于新鲜含血清培养基中。随后按1:2或1:3的比例进行传代培养。
【数据】培养基：高糖DMEM + 10% FBS + 1%青霉素-链霉素（HEK293T/HeLa）；高糖DMEM + 10% FBS + 1%青霉素-链霉素 + 1% L-谷氨酰胺（HSkMC）；传代汇合度：70–90%；胰蛋白酶浓度：0.25%胰蛋白酶-EDTA；消化温度：37 °C；消化时间：1–3 min；离心转速：1000 rpm；离心时间：3 min；传代比例：1:2或1:3
细胞转染与药物处理
HEK293T细胞接种于6孔板中，培养至70–90%汇合度。转染前将培养基更换为新鲜完全培养基。转染操作严格按照Lipofectamine 3000（Thermo Fisher Scientific Inc.，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆）制造商提供的标准方案执行。转染后6 h更换培养基，随后加入小分子化合物（Nocodazole）共孵育48 h，之后收集样本进行后续分析。
【数据】转染试剂：Lipofectamine 3000；转染后换液时间：6 h；小分子化合物：Nocodazole；共孵育时间：48 h；细胞汇合度：70–90%
TA克隆
HEK293T细胞接种于6孔板中，培养至70–90%汇合度。转染前将培养基更换为新鲜完全培养基。转染操作严格按照Lipofectamine 3000官网提供的标准方案执行。处理后48 h从各独立样本组分别收集目标细胞DNA，在PCR仪中以下列条件扩增：95 °C 5 min；30个循环（95 °C 30 s，58 °C 30 s，72 °C 30 s）；最终延伸72 °C 10 min。扩增的PCR产物克隆至pGEM-T Easy载体（Promega，美国威斯康星州麦迪逊），转化至大肠杆菌DH5α，涂布于LB琼脂平板。随机挑取大肠杆菌菌落进行质粒提取；通过琼脂糖凝胶电泳和Sanger测序鉴定重组质粒。
【数据】PCR条件：95 °C 5 min；（95 °C 30 s，58 °C 30 s，72 °C 30 s）× 30循环；72 °C 10 min；载体：pGEM-T Easy；感受态：E. coli DH5α；平板：LB琼脂；DNA收集时间：处理后48 h
Western blot
用RIPA缓冲液从293T细胞中提取蛋白并经离心澄清后，进行蛋白浓度定量（BCA法）。取等量蛋白经SDS-PAGE分离，转移至PVDF膜，用5% BSA封闭。以一抗（anti-EGFP，1:2000；anti-β-actin，1:5000）和二抗孵育后，检测信号并通过光密度分析（ImageJ）测定以β-actin归一化的表达水平。
【数据】裂解液：RIPA缓冲液；蛋白定量：BCA法；封闭液：5% BSA；一抗稀释比：anti-EGFP 1:2000，anti-β-actin 1:5000；分析软件：ImageJ；归一化内参：β-actin
位点特异性KI效率测定
如上所述，处理后48 h通过流式细胞术分析EGFP阳性细胞以确定KI/HDR效率。为校正转染变异，使用mCherry-Cas9载体的实验设门于mCherry阳性细胞。最终KI效率通过将EGFP阳性率对mCherry转染率归一化得出。
【数据】检测时间：处理后48 h；检测方法：流式细胞术；归一化方式：EGFP阳性率/mCherry转染率；校正载体：mCherry-Cas9
细胞活力
为评估Nocodazole对细胞活力的影响，进行CCK-8 assay。将细胞接种于96孔板，用指定浓度的化合物处理48 h，然后与CCK-8试剂在37 °C孵育2 h。通过酶标仪记录450 nm处光密度值定量细胞活力。
【数据】试剂：CCK-8；处理时间：48 h；孵育温度：37 °C；孵育时间：2 h；检测波长：450 nm
统计分析
使用GraphPad Prism 9.5软件进行数据可视化和统计绘图。所有实验均设三个重复，结果以均值 ± 标准差（SD）表示。两组间比较采用双尾非配对t检验，多组间差异采用单因素方差分析（one-way ANOVA）评估。统计学显著性定义为p < 0.05。
【数据】软件：GraphPad Prism 9.5；重复数：3；数据表示：均值 ± SD；两组比较：双尾非配对t检验；多组比较：单因素方差分析；显著性阈值：p < 0.05
研究结果
PALB2修饰的CRISPR/Cas9系统构建
PALB2修饰的Cas9融合蛋白通过一个16残基肽链接头（SGSETPGTSESATPES）将PALB2连接至Cas9的C端而构建（图1A）。鉴于实验变异可能带来的混杂效应，通过T2A序列将mCherry报告基因整合到构建体中（图1B）。mCherry阳性率随后作为内部对照，通过归一化消除转染相关偏差，从而精确校准基于HDR的基因组编辑效率。Western blot结果显示PALB2蛋白表达水平显著升高，证明通过链接头成功实现了Cas9和PALB2的共表达（补充图S1A）。本研究中，我们靶向GAPDH基因，该基因已知在整个细胞周期中组成型表达（文献31）。为直观评估CRISPR/Cas9介导的KI效率，将携带EGFP的目标基因DNA序列整合到GAPDH位点的末端外显子。为防止修复过程中同源修复模板中末端外显子序列被错误识别为3′同源臂，本研究通过密码子简并性重新设计了该外显子（补充图S2C和D）。该策略保留了GAPDH的分子功能，同时防止其意外整合到目标基因组中（图1C）。
【数据】链接头：16残基肽（SGSETPGTSESATPES）；连接位置：Cas9 C端；报告基因：mCherry（经T2A序列）；靶基因：GAPDH；整合位置：末端外显子；验证方法：Western blot；外显子重设计：密码子简并性
构建的CRISPR系统可实现目标基因整合
为评估所建立的CRISPR/Cas9-PALB2系统在GAPDH位点介导EGFP位点特异性整合的靶向精度，并在定量流式细胞术分析前初步验证KI效率，本研究采用HEK293T细胞作为验证模型。将常规Cas9或Cas9-PALB2融合表达载体转染HEK293T细胞。转染后48 h提取基因组DNA，使用位于同源臂内的引物（HA-F和HA-R；补充图S1B）进行PCR扩增。琼脂糖凝胶电泳显示两组均出现预期大小的扩增片段：1519 bp条带对应目标位点成功整合EGFP，402 bp条带代表未修饰的GAPDH等位基因（图2A）。为进一步评估KI效率和整合保真度，将PCR产物克隆至pGEM-T Easy载体并转化至大肠杆菌DH5α。经蓝白斑筛选后，随机选取共46个白色菌落（每组各23个）进行质粒扩增及PCR鉴定。凝胶电泳表明Cas9-PALB2组产生5个KI阳性克隆，而对照组仅鉴定出2个阳性克隆（图2B），提示PALB2融合显著增强了HDR介导的基因KI效率。随后，对全部46个单克隆菌落进行Sanger测序以验证整合精度。测序结果显示两组所有阳性克隆均在GAPDH位点实现了EGFP的准确框内插入，未检测到插入或缺失，证实通过HDR途径实现了精确修复。相比之下，未发生靶向整合的克隆表现出NHEJ介导修复特征的小片段插入缺失。鉴于这些突变的高度异质性和随机性，本文仅展示精确KI克隆的测序结果（补充图S1C）；NHEJ介导的随机突变不逐一展示。与上述发现一致，免疫荧光分析进一步证实了两种系统中EGFP的整合，其中Cas9-PALB2融合表达的HEK293T细胞表现出明显更高的KI效率（图2C）。总之，两种CRISPR系统均能在GAPDH位点实现EGFP的精准靶向整合，而Cas9-PALB2融合策略显著增强了HDR介导的KI效率。
【数据】细胞模型：HEK293T；转染后DNA提取时间：48 h；PCR产物大小：KI阳性1519 bp，未修饰GAPDH等位基因402 bp；挑取白色菌落数：46个（每组23个）；KI阳性克隆：Cas9-PALB2组5个，对照组2个；测序方法：Sanger测序；验证方法：琼脂糖凝胶电泳、免疫荧光
PALB2融合Cas9在HEK293T细胞中提高KI效率
将CRISPR/Cas9和CRISPR/Cas9-PALB2系统分别转染HEK293T细胞。48 h后，结果显示CRISPR/Cas9-PALB2系统外源基因EGFP的蛋白表达水平高于CRISPR/Cas9系统（图3A）。流式细胞术显示，Cas9-PALB2融合蛋白使EGFP阳性细胞比例提高约7个百分点（从约12%升至19%）（图3B和C）。为减少不同系统间递送效率的误差，本研究使用T2A连接肽在Cas9蛋白C端串联表达mCherry进行校正。为评估其效用，在293T细胞中测试了该系统通过HDR在GAPDH位点进行EGFP标记的能力。经转染率归一化后，相对于未融合Cas9对照，HDR效率提升1.7倍（图3D）。这些数据表明PALB2融合是在CRISPR/Cas9框架内提高HDR的广泛有效策略。
【数据】细胞：HEK293T；检测时间：48 h；EGFP阳性率：从约12%升至约19%（提高约7个百分点）；归一化后HDR效率提升：1.7倍；校正方式：T2A-mCherry串联表达；检测方法：Western blot、流式细胞术
PALB2融合CRISPR联合Nocodazole显著提高HEK293T细胞KI效率
通过小分子进行药理学调控是提高动物细胞系统HDR速率的实用方法（文献32–34）。Nocodazole预处理可将G2-M期比例提高至80%（文献35）。用Nocodazole预处理不同细胞类型可大幅提高短插入片段的HDR速率（文献36）。本研究中，使用Nocodazole提高基因KI效率。在剂量依赖性实验中，Nocodazole在0.3 μM时对促进KI效率效果最佳（图4A）。然而，该浓度下与二甲基亚砜处理的对照组相比，显著降低了293T细胞的细胞活力（图4B）。因此，选择0.2 μM与Cas9-PALB2融合蛋白联合应用。HEK293T细胞共转染后与0.2 μM Nocodazole孵育48 h。流式细胞术分析发现Cas9-PALB2可将KI效率提高至25.5%（图4C和D）。我们进一步在额外细胞系中评估该联合方案，观察到KI效率的显著增强。CCK-8 assay检测了HeLa和HSkMC细胞经小分子处理后的细胞活力。分别选择0.1 μM和0.2 μM浓度进行药物处理（图5A和B）。在EGFP标记系统中，HeLa和HSkMC细胞的KI效率分别提高约1.8倍和1.9倍。联合处理的效果优于单独应用Cas9-PALB2或Nocodazole。
【数据】Nocodazole最佳浓度（单独）：0.3 μM；联合使用浓度：0.2 μM；孵育时间：48 h；Cas9-PALB2 + Nocodazole KI效率：25.5%；HeLa细胞药物浓度：0.1 μM；HSkMC细胞药物浓度：0.2 μM；HeLa KI效率提升：约1.8倍；HSkMC KI效率提升：约1.9倍；Nocodazole预处理G2-M期比例：80%（文献值）；检测方法：流式细胞术、CCK-8 assay
讨论与解读
研究者已探索多种提高KI效率的方法，包括sgRNA设计、供体修饰和同源臂长度优化。这些方法推动了基因编辑进步，在一定程度上提高了KI效率，但仍存在局限。优化CRISPR系统组件往往需要精确调整多个参数，且不同细胞类型和基因位点需求各异，难以找到普适的最优组合。相比之下，从细胞损伤修复过程出发、利用其天然修复机制，可更精准地整合基因KI，减少错误突变，更符合正常生理。近期研究聚焦于通过激活或过表达HDR相关因子提高KI效率。据报道，通过S-1（RAD51激活剂）激活RAD51表达可提高大鼠ROSA26样位点（RLL）基因的GFP基因打靶KI效率（文献34）；过表达RAD18可使KI效率提高约1.5–2倍（文献37）。另一种提高KI效率的方法与HDR无直接关联——例如Cas9-mTHAP11融合蛋白可通过增加供体DNA的可及性提高HDR效率，为改善KI效率提供了新途径（文献38），但在临床应用前必须彻底评估鼠源THAP11可能的临床风险。鉴于PALB2对DNA损伤的同源重组修复途径至关重要……
编译者解读
该研究巧妙地将内源DNA修复机器"招募"到编辑位点——PALB2作为BRCA2-PALB2-RAD51通路的关键节点，其融合策略绕开了复杂参数调优的困境。1.7倍的基础提升虽不算惊艳，但与Nocodazole联用后25.5%的KI效率在同类研究中颇具竞争力。值得关注的是，该策略在三种细胞系中均有效，提示其不依赖特定细胞背景。不过，PALB2融合对Cas9蛋白结构的影响、长期表达是否引发基因组不稳定性，以及原代细胞中的表现，仍需进一步验证。总体而言，这是一种"借力打力"的务实思路，为HDR增强提供了可模块化叠加的新组件。
参考来源
期刊：Journal of Bioscience and Bioengineering, 2026
DOI: 10.1016/j.jbiosc.2026.05.004
DOI: 10.1016/j.jbiosc.2026.05.004