来源：In situ spatiotemporal tracking of endogenous protein dynamics with allosteric genetically encoded biosensor in living cells（Biosensors and Bioelectronics）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
蛋白质的功能由其丰度和亚细胞定位决定，但现有成像方法依赖过表达或基因组编辑，仅适用于外源或修饰蛋白，且可能引入伪影。本文报道了一种名为Step（时空追踪内源蛋白）的变构生物传感器，由靶蛋白识别适配体和双锁定荧光适配体模块组成。环状Step（circStep）系统将单次POI-适配体结合事件转化为变构开关，同时解锁两个笼状荧光适配体M18，恢复其活性构象并产生稳健荧光信号，实现对天然POI定位和丰度波动的高保真实时追踪。
研究背景
蛋白质丰度和分布受到严格调控，异常表达和定位与多种疾病相关。在活细胞内可视化蛋白质的定位和动态，对理解其生命周期过程——包括表达、运输、相互作用和降解——以及整体功能至关重要。免疫荧光（IF）最常用于固定细胞中目标蛋白的可视化，但传统IF技术不适合追踪活细胞中的蛋白质。基于荧光的策略，从基因编码标签到化学探针，已革新了活细胞蛋白质可视化。其中，基因编码标签如荧光蛋白（FP）融合、多种自标记蛋白标签和肽标签，已被广泛用于活细胞中追踪蛋白质。尽管这些成熟的遗传操作策略很有价值，但它们通常依赖过表达，且仅限于在N端或C端或柔性环内融合标签，可能破坏目标蛋白的天然细胞环境、折叠、定位和功能，并在下游分析中引入伪影。
研究方法
2.1 一般信息
T7 RNA聚合酶购自Novoprotein公司（中国上海）。Phanta Max超保真DNA聚合酶购自Vazyme（中国南京）。RevertAid逆转录酶、DNase I、RiboLock RNase抑制剂、链霉亲和素偶联的T1 Dynabeads、青霉素-链霉素和dNTP套装购自Thermo Fisher Scientific（美国马萨诸塞州沃尔瑟姆）。NTP混合物、焦碳酸二乙酯（DEPC）处理水和DMSO购自生工生物（中国上海）。生物素-16-UTP购自APExBIO（美国休斯顿）。限制性内切酶（Age I和EcoR I、HindⅢ和Nhe I）、10×NEBuffer™ 2和T4 DNA连接酶购自New England Biolabs有限公司（美国马萨诸塞州伊普斯维奇）。RNAiso Plus试剂购自Takara（日本）。LipoMax™试剂购自Sudgen（中国南京）。Hoechst 33342、Cell Counting Kit-8购自碧云天（中国上海）。HBC514、TNF-α、BAY 11-7082和Poly (I:C)购自MedChemExpress（美国新泽西州蒙茅斯 Junction）。Real-time PCR Easy™-SYBR Green I和ECL化学发光底物购自Foregene（中国成都）。小鼠单克隆ADAR1 p150抗体（sc-73408）购自Santa Cruz Biotechnology（美国德克萨斯州）。小鼠多克隆ADAR1抗体（14330-1-AP）购自Proteintech（美国罗斯蒙特）。NF-κB p65多克隆抗体、Histone H3多克隆抗体、GAPDH多克隆抗体和HRP偶联Affinipure山羊抗小鼠IgG（H + L）购自Proteintech（美国罗斯蒙特）。所有细胞培养基购自BasalMedia（中国上海）。胎牛血清（FBS）购自Excell Bio（中国上海）。所有寡核苷酸由生工生物（中国上海）合成，序列列于表S1–2和表S4–5。
【数据】试剂来源：T7 RNA聚合酶（Novoprotein）；Phanta Max超保真DNA聚合酶（Vazyme）；RevertAid逆转录酶、DNase I、RiboLock RNase抑制剂、链霉亲和素T1 Dynabeads、青霉素-链霉素、dNTP套装（Thermo Fisher Scientific）；NTP混合物、DEPC水、DMSO（生工生物）；生物素-16-UTP（APExBIO）；限制性内切酶Age I、EcoR I、HindⅢ、Nhe I、10×NEBuffer™ 2、T4 DNA连接酶（New England Biolabs）；RNAiso Plus（Takara）；LipoMax™（Sudgen）；Hoechst 33342、CCK-8（碧云天）；HBC514、TNF-α、BAY 11-7082、Poly (I:C)（MedChemExpress）；Real-time PCR Easy™-SYBR Green I、ECL底物（Foregene）；ADAR1 p150抗体sc-73408（Santa Cruz）；ADAR1抗体14330-1-AP、NF-κB p65抗体、Histone H3抗体、GAPDH抗体、HRP偶联山羊抗小鼠IgG（Proteintech）；细胞培养基（BasalMedia）；FBS（Excell Bio）；寡核苷酸（生工生物）
2.2 光谱测量
纯化的Step（1 μM）与其同源POI（1 μM）在20 μL的1× NEB Buffer 2（50 mM NaCl、10 mM Tris-HCl、10 mM MgCl₂、1 mM DTT，25 °C时pH 7.9）中于37 °C孵育30分钟。然后将该混合物加入含HBC514（1 μM）的1× HBC反应缓冲液（40 mM HEPES pH 7.5、100 mM KCl、5 mM MgCl₂）中，最终体积为100 μL荧光检测体系。随后样品在37 °C孵育10分钟，加入黑色底96孔板。最后在室温下用Bio-Tek Synergy H1测量荧光强度（激发=460 nm，发射=514 nm）。对于荧光扫描光谱，激发波长为460 nm，发射波长设为490–600 nm范围，狭缝宽度为10 nm。
【数据】Step浓度：1 μM；POI浓度：1 μM；缓冲液：1× NEB Buffer 2（50 mM NaCl、10 mM Tris-HCl、10 mM MgCl₂、1 mM DTT，pH 7.9）；孵育温度：37°C；孵育时间：30 min；HBC反应缓冲液：40 mM HEPES pH 7.5、100 mM KCl、5 mM MgCl₂；HBC514浓度：1 μM；终体积：100 μL；二次孵育温度：37°C；二次孵育时间：10 min；激发波长：460 nm；发射波长：514 nm；扫描范围：490–600 nm；狭缝宽度：10 nm
2.3 活细胞共聚焦显微镜成像
对于活细胞中所有目标的共聚焦显微镜成像，circStep质粒转染24小时后，将细胞接种于玻璃底激光共聚焦培养皿中，确保次日细胞汇合度约为60%。成像前，细胞用1×PBS洗涤两次，然后用Hoechst 33342溶液在37 °C染色10分钟。弃去染色液后，细胞用1×PBS洗涤两次，然后与荧光团染色缓冲液（终浓度2 μM HBC或100 μM DFHBI-1T荧光团，用含5% FBS的1×PBS细胞维持液稀释）在37 °C孵育10分钟。使用转盘显微镜拍摄细胞显微照片。不同荧光通道的参数根据细胞荧光实际情况确定（Hoechst 33342：λex = 405 nm，λem = 415–475 nm，蓝色通道；HBC514/DFHBI-1T：λex = 488 nm，λem = 500–550 nm，绿色通道；HBC620：λex = 568 nm，λem = 580–620 nm，红色通道）。所有图像由配备100×（或63×油镜）物镜的转盘共聚焦显微镜（Zeiss CELL Observer SD）拍摄。所有样品在相同参数下拍摄。数据用“ZEN”软件分析。对于3D成像，细胞转染circStep（NF-κB）质粒24小时，接种于玻璃底培养皿中培养至50%汇合。Hoechst 33342和HBC514荧光团染色后，用转盘共聚焦显微镜以1 μm间隔的不同z轴间距扫描z-stack图像的实时3D投影，并用ZEN软件进行3D重建处理。
【数据】转染时间：24 h；细胞汇合度：约60%；Hoechst 33342染色温度：37°C；染色时间：10 min；HBC终浓度：2 μM；DFHBI-1T终浓度：100 μM；荧光团孵育温度：37°C；孵育时间：10 min；Hoechst 33342通道：λex = 405 nm，λem = 415–475 nm；HBC514/DFHBI-1T通道：λex = 488 nm，λem = 500–550 nm；HBC620通道：λex = 568 nm，λem = 580–620 nm；物镜：100×或63×油镜；3D成像z轴间距：1 μm；3D成像细胞汇合度：50%
2.4 活细胞中蛋白质动态的实时追踪
对于使用circStep实时监测蛋白质动态，HeLa细胞转染circStep（ADAR1）质粒24小时，用Poly (I:C)（500 ng/mL）刺激预定时间。然后染色细胞，使用转盘共聚焦显微镜（Zeiss CELL Observer SD）连续观察和成像一段时间（拍摄延时图像，每5分钟一帧）。对于监测蛋白质NF-κB核或质转位的时空动态，HeLa细胞转染circStep（NF-κB）质粒24小时，接种于玻璃底培养皿中，次日细胞汇合度达60%。然后加入TNF-α刺激细胞中NF-κB的核转位。随后染色细胞，使用转盘共聚焦显微镜连续观察和成像（拍摄延时图像，每30秒一帧）。此外，在动态成像中，细胞培养皿最初置于载物台上并聚焦，然后固定位置直至整个拍摄过程完成。
【数据】转染时间：24 h；Poly (I:C)浓度：500 ng/mL；延时拍摄间隔（ADAR1）：每5 min一帧；细胞汇合度（NF-κB）：60%；延时拍摄间隔（NF-κB）：每30 s一帧
2.5 流式细胞术分析
对于转染circStep质粒细胞的荧光强度流式细胞术分析，不同细胞转染相应circStep质粒48小时。然后消化细胞，1000 g、4 °C离心5分钟，弃上清，用冷1×PBS洗涤细胞，重悬于适当体积的细胞维持液（含5% FBS的1×PBS）中。随后向细胞悬液中加入HBC514（200 nM），轻轻混匀，置于37 °C培养箱中20分钟。孵育后，将细胞悬液置于冰上，用流式细胞仪（BD FACScalibur，美国）分析每样品10,000个细胞的荧光强度。所有待测样品在相同参数下操作。数据用“FlowJo”软件（V10，BD）处理和分析。
【数据】转染时间：48 h；离心条件：1000 g、4°C、5 min；HBC514浓度：200 nM；孵育温度：37°C；孵育时间：20 min；分析细胞数：10,000个/样品；流式细胞仪：BD FACScalibur；分析软件：FlowJo V10
研究结果
3.1 使用微孔-SELEX鉴定靶向ADAR1蛋白的RNA适配体
ADAR1（腺苷脱氨酶，RNA特异性1）通过将双链RNA中的腺苷转化为肌苷来调控RNA诱导的免疫反应。基于ADAR1已开发了一系列RNA单碱基编辑技术。它也是衰老和免疫的重要调节因子。然而，过表达ADAR1会引发广泛的脱靶RNA编辑，使传统融合蛋白成像与ADAR1不兼容，阻碍了对其真实功能的研究。因此，选择ADAR1作为概念验证靶标来开发Step。首先，为分离靶向ADAR1并作为POI传感模块的RNA适配体，以HEK-293T细胞产生的ADAR1 p150蛋白（图S1a）为靶标，进行本课题组建立的微孔-SELEX实验（Wang et al., 2024）。在本工作中，我们升级了微孔-SELEX：将先前用于DNA适配体筛选的策略改造为RNA适配体筛选（图1a）。简言之，ssDNA文库包含众多片段，每个片段含有一个25 nt随机核心，两侧为确定的恒定区，5′端含有T7启动子用于体外转录。微孔板用ADAR1 p150蛋白（全长）包被，与体外转录RNA文库孵育进行SELEX。为减少非特异性结合RNA，从第六轮后开始引入ADAR1 p150敲低HEK-293T细胞的总蛋白作为负靶标进行反筛选。经过额外十二轮筛选后，富集的适配体池通过下一代测序分析。其中，酶联免疫吸附测定（ELISA）确认A-Apt4为最高亲和力变体，被选为候选适配体（图1b）。ADAR1 p150除脱氨酶结构域（绿色）外，含有两个左手Z-核酸（Z-RNA）结合结构域（Zα和Zβ，蓝色）和三个dsRNA结合结构域（RBD-I、RBD-II和RBD-III，黄色）（Chen et al., 2025；Rehwinkel和Mehdipour, 2025）。我们用RNA composer分析了A-Apt4的3D结构，并进行分子对接模拟，揭示蓝色标记的核碱基参与与RBDs的结合（图1c），暗示A-Apt4不太可能干扰ADAR1的脱氨酶活性。根据结构和对接结果，对A-Apt4的非必需区域进行截短和优化，包括A-Apt4-1、A-Apt4-2、A-Apt4-3和A-Apt4-4，分别去除5′和3′端序列中潜在的非必需序列（图S1b）。截短变体适配体A-Apt4-3明显优于其余变体，因其高亲和力水平与A-Apt4相当（图1d，图S1c）。尽管A-Apt4-1和A-Apt4-2含有A-Apt4-3的序列，但其结合亲和力显著低于A-Apt4-3，暗示额外序列也可能干扰RNA构象的正确折叠。这种结合能力通过流式细胞术和荧光图像进一步确认（图S1d–e）。结合动力学通过生物层干涉术（BLI）测定，A-Apt4-3的解离常数（Kd）为62.19 nM，与A-Apt4（64.77 nM）相当，证明其高亲和力（图1e）。此外，适配体A-Apt4-3的分子对接模拟与适配体A-Apt4高度一致（图1f）。总体而言，这些结果表明RNA适配体A-Apt4-3具有优越的靶向ADAR1 p150蛋白的结合能力。随后，为基准评估A-Apt4-3的结合亲和力及其在p150上的表位，我们采用充分表征的R/G基序（55 nt）作为阳性对照（Merkle et al., 2019；Reautschnig et al., 2022）。这个20-bp的不完美发夹已知可招募内源性ADARs并指导位点特异性RNA编辑。BLI分析显示R/G基序的Kd为204.05 nM，表明A-Apt4-3的亲和力比R/G基序高3倍以上（图1g，图S1f）。竞争性ELISA结果显示适配体A-Apt4-3和R/G基序结合ADAR1蛋白的同一表位（图1h）。分子动力学模拟进一步确认不干扰脱氨酶活性的R/G基序也结合ADAR1 p150的RBDs，这与RNA适配体A-Apt4-3一致（图S1g），表明适配体A-Apt4-3既不阻碍也不改变ADAR1的脱氨酶活性。此外，选择性是另一个非常重要的性能。我们评估了适配体A-Apt4-3与表达不同量ADAR1 p150的细胞裂解液的结合能力。ELISA分析显示荧光与ADAR1 p150的表达呈正相关（图S1h–i）。进一步，我们探究适配体A-Apt4-3是否能区分ADAR1的两个剪接变体p150和p110：两者均含Zβ结构域，但仅ADAR1 p150携带额外的Zα结构域和核输出信号（NES）（图1i）。我们进一步对p110和适配体A-Apt4-3进行分子对接模拟，发现p110和p150的蛋白质折叠构象不完全相同，表明Zα结构域对蛋白质构象折叠有适度影响。此外，分子对接模拟揭示尽管适配体A-Apt4-3也结合ADAR1 p110的RBD区域，但结合位点显著减少（图S1j）。同时，ELISA分析显示适配体A-Apt4-3同时结合p150和p110，但对p150的亲和力明显更高（图1j），这与分子对接模拟结果一致。总的来说，这些结果表明已成功分离出A-Apt4-3——一种高亲和力抗ADAR1 RNA适配体，不扰动ADAR1的脱氨酶活性，适合下游研究。特异性必须在后续Step设计中明确工程化。
【数据】ssDNA文库随机核心：25 nt；反筛选起始轮次：第六轮后；额外筛选轮次：12轮；A-Apt4-3 Kd：62.19 nM；A-Apt4 Kd：64.77 nM；R/G基序长度：55 nt；R/G基序Kd：204.05 nM；亲和力倍数：A-Apt4-3比R/G基序高3倍以上；ADAR1 p150结构域：2个Z-RNA结合结构域（Zα和Zβ）、3个dsRNA结合结构域（RBD-I、RBD-II、RBD-III）、1个脱氨酶结构域；p150 vs p110差异：p150含额外Zα结构域和NES
3.2 变构Step的设计与性能优化
变构Step的设计如图2a所示。为使Step能够在活细胞中原位追踪天然蛋白质，我们引入tornado表达系统产生无5′和3′端的环状Step（circStep），可有效防止外切核酸酶降解（Litke和Jaffrey, 2019）。如我们先前的研究（Yuan et al., 2025；Zheng et al., 2022），我们通过将线性Step和F30支架（橙色）融合体两侧连接两个twister核酶（紫色）来工程化circStep；自催化切割产生互补末端，由内源性RNA连接酶RtcB密封形成circStep。其中，Step包含四个功能模块：1）一个POI传感模块（蓝色），本质上是一个特异性结合POI的适配体，作为输入信号识别元件；2）两个发光RNA适配体模块（M18，绿色）作为荧光报告元件；3）双锁定模块（左输出锁和右输出锁，黑色），与M18部分互补以关闭输出信号M18；4）输入锁（绿色），与POI传感模块部分配对以封闭输入信号。在POI不存在时，Step被输入和输出锁模块锁定为非活性、排除荧光染料的构象，隔离两个M18适配体。与适配体结构域结合后，蛋白质触发构象开关，恢复活性结构，释放M18片段进入其活性折叠，捕获荧光染料并点燃明亮、可检测的荧光。总体而言，Step将单次POI-适配体结合事件转化为变构开关，同时激活两个荧光适配体，实现定量POI分析。
【数据】circStep组成：线性Step + F30支架 + 2个twister核酶；Step功能模块：1个POI传感模块（适配体）、2个发光RNA适配体模块（M18）、2个双锁定模块（左输出锁和右输出锁）、1个输入锁；密封酶：内源性RNA连接酶RtcB
3.3 构建环状Step以可视化活细胞中的天然ADAR1
为验证circStep在活细胞中可视化天然ADAR1的能力，我们进行了共聚焦荧光成像。HeLa细胞转染编码circStep的质粒48小时，使用转盘共聚焦显微镜拍摄。Mut-Step：具有突变POI传感模块的circStep，无法结合靶标。如图3a所示，转染circStep（ADAR1）的HeLa细胞在绿色通道中显示强荧光信号，而转染Mut-Step的细胞显示可忽略的荧光，证明circStep对ADAR1的特异性响应。此外，circStep（ADAR1）的荧光信号主要定位于细胞质，与ADAR1 p150的已知亚细胞定位一致。为确认circStep检测的是内源性ADAR1而非外源表达蛋白，我们使用ADAR1特异性siRNA敲低ADAR1。如图3b所示，ADAR1敲低后circStep荧光信号显著降低，而对照siRNA处理的细胞保持强荧光，证明circStep确实检测内源性ADAR1。我们进一步测试了circStep是否影响ADAR1的脱氨酶活性。进行RNA编辑实验，结果显示circStep表达不影响ADAR1介导的RNA编辑效率（图S2），确认circStep不干扰ADAR1功能。此外，我们评估了circStep的灵敏度。用不同量circStep质粒转染HeLa细胞，观察到荧光强度呈质粒剂量依赖性增加（图3c）。流式细胞术分析进一步确认circStep荧光强度与ADAR1表达水平正相关（图3d）。这些结果表明circStep能够以高特异性和灵敏度可视化活细胞中的天然ADAR1。
【数据】转染时间：48 h；成像设备：转盘共聚焦显微镜；Mut-Step：突变POI传感模块，无法结合靶标；circStep（ADAR1）荧光定位：细胞质；敲低方法：ADAR1特异性siRNA；检测目标：内源性ADAR1；RNA编辑实验：circStep表达不影响ADAR1介导的RNA编辑效率；灵敏度：荧光强度呈质粒剂量依赖性增加；流式细胞术：荧光强度与ADAR1表达水平正相关
3.4 监测NF-κB核转位的时空动态
为展示circStep监测蛋白质转位的时空动态能力，我们构建了靶向NF-κB的circStep。NF-κB是一种转录因子，在静息状态下主要定位于细胞质，在TNF-α等刺激下迅速转位至细胞核。circStep（NF-κB）的结构如图4a所示，NF-κB传感适配体的序列信息也一并展示。我们首先验证了circStep（NF-κB）在活HeLa细胞中的性能。如图4b所示，转染circStep（NF-κB）的HeLa细胞在绿色通道中显示荧光信号，主要定位于细胞质。用TNF-α刺激后，circStep（NF-κB）荧光信号迅速从细胞质转位至细胞核，与NF-κB的已知行为一致。相反，转染Mut-circStep的细胞在TNF-α刺激后未显示荧光转位，证明circStep（NF-κB）特异性检测NF-κB。为实时追踪NF-κB核转位，我们每30秒拍摄延时图像。如图4c所示，TNF-α刺激后circStep（NF-κB）荧光信号在约5分钟内从细胞质转位至细胞核，并在约15分钟后返回细胞质。这一动态过程通过共聚焦显微镜清晰捕捉。此外，我们使用BAY 11-7082（一种NF-κB抑制剂）预处理细胞，观察到BAY 11-7082显著抑制TNF-α诱导的NF-κB核转位（图4d），证明circStep可用于监测NF-κB转位的药理学调控。我们还进行了3D成像以可视化NF-κB的核转位。如图4e所示，z-stack图像和3D重建清晰显示NF-κB从细胞质到细胞核的转位。这些结果表明circStep能够实时、动态地追踪活细胞中蛋白质的核转位。
【数据】靶标：NF-κB；静息状态定位：细胞质；刺激物：TNF-α；转位时间：约5 min从细胞质到细胞核；返回时间：约15 min后返回细胞质；延时拍摄间隔：每30 s一帧；抑制剂：BAY 11-7082；3D成像z轴间距：1 μm；Mut-circStep：无荧光转位
3.5 基于成像的高通量筛选重编程蛋白质核质定位的调控因子
基于circStep平台，我们建立了基于成像的高通量筛选平台，用于鉴定重编程蛋白质核质定位的调控因子。工作流程如图5a所示：使用circStep在转盘共聚焦显微镜上进行基于成像的高通量筛选。该平台利用circStep监测POI的核质定位变化，通过自动化成像和图像分析筛选化合物或基因。我们使用circStep（NF-κB）作为概念验证进行筛选。用化合物库处理转染circStep（NF-κB）的HeLa细胞，然后TNF-α刺激，通过自动化共聚焦显微镜成像，分析NF-κB的核质定位。如图5b所示，筛选鉴定出多个调控NF-κB核转位的化合物。其中，BAY 11-7082（已知NF-κB抑制剂）被鉴定为阳性对照，验证了筛选平台的可靠性。此外，筛选还鉴定出其他调控NF-κB定位的化合物，证明该平台可用于高通量筛选重编程蛋白质定位的调控因子。这些结果表明circStep平台不仅能够追踪内源蛋白质动态，还可扩展为强大的高通量筛选工具，用于药物发现，特别是重编程蛋白质定位的疗法。
【数据】筛选平台：基于成像的高通量筛选；靶标：NF-κB；刺激物：TNF-α；阳性对照：BAY 11-7082；筛选结果：鉴定出多个调控NF-κB核转位的化合物
讨论与解读
蛋白质功能与其丰度和独特的亚细胞定位相关。在生物学条件下进行蛋白质分析对于理解其功能不可或缺。迄今为止，活细胞中工程化或修饰蛋白质的分布和动态成像技术已有应用。这些方法通常需要过表达POI或操作基因组，可能导致错误结论。本文工程化了一种变构生物传感器，将单次POI-适配体结合事件转化为变构开关，用于荧光POI检测，抗POI适配体作为识别结构域，发光适配体作为信号报告器。circStep能够原位捕获和实时监测天然POI，可视化其定位、浓度动态和运动。这不仅为阐明活细胞中真实功能提供了强大工具，还建立了强大的高内涵平台，用于按需重编程蛋白质再定位。与需要过表达并报告外源蛋白的荧光蛋白融合相比，circStep使用POI特异性适配体感知内源性天然蛋白质——更好地反映其真实生理状态。不同于依赖编辑效率的基因组编辑平台，circStep既不编辑DNA也不编辑RNA，规避了编辑效率限制。
编译者解读：本研究核心创新在于将适配体从单纯的识别元件升级为变构开关，通过双锁定M18设计实现"单次结合、双倍信号"的输出逻辑，显著降低背景并提高特异性。circStep的"即插即用"特性使其可快速适配不同POI，仅需替换传感适配体序列。然而，该技术目前依赖外源递送circStep质粒，体内应用的递送效率和免疫原性仍需评估；适配体的筛选周期和亲和力仍是限速步骤。总体而言，该平台为内源蛋白动态研究提供了不干扰生理状态的新范式，在药物筛选中具有转化潜力。
参考来源
期刊：Biosensors and Bioelectronics, 2026
DOI: 10.1016/j.bios.2026.118829
DOI: 10.1016/j.bios.2026.118829