来源：Improved S-adenosylmethionine and glutathione biosynthesis in Candida utilis via elevated endogenous sulfur-containing amino acid supply（Food Bioscience）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
S-腺苷甲硫氨酸（SAM）和谷胱甘肽（GSH）是功能食品制造中广泛使用的两种重要含硫生物活性成分。本研究在产朊假丝酵母中对硫代谢核心基因MET15进行代谢工程改造，构建了基因敲除（met15Δ）、过表达（MET15-OE）和回补（met15Δ::MET15）三株工程菌。过表达菌株显著提升了胞内L-甲硫氨酸和L-半胱氨酸水平，增强了关键酶活性，重塑了碳通量并强化了胞内能量再生。补料分批培养中MET15-OE最高细胞干重达69.04 g/L，SAM与GSH协同产量达2,242.7 mg/L，较亲本菌株提高49.1%。
研究背景
SAM是体内主要的甲基供体，参与DNA、RNA、蛋白质和脂质的甲基化反应，调控细胞增殖、表观遗传修饰和代谢稳态。GSH则是细胞内主要的抗氧化剂，负责清除活性氧、减轻氧化损伤，并参与细胞解毒和免疫调节。凭借多样的生物学功能，SAM和GSH在功能食品、制药和化妆品行业得到广泛应用。
SAM和GSH的生物合成与硫代谢网络及含硫氨基酸合成途径紧密耦合，L-甲硫氨酸和L-半胱氨酸是核心前体和关键调控节点。SAM由L-甲硫氨酸和ATP经甲硫氨酸腺苷转移酶（MAT）催化一步合成。GSH的合成则涉及两步连续的ATP依赖型酶促反应，由γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶（γ-GCS）和谷胱甘肽合成酶依次催化。在食品级微生物细胞工厂的选择上，产朊假丝酵母相比酿酒酵母具有细胞增殖快、无机硫同化能力强且无致病风险等优势，更适合SAM和GSH的大规模协同生产。然而，传统代谢调控研究多局限于工艺参数优化或能量供给强化，未能从根本上解决上游含硫氨基酸合成通量不足的代谢瓶颈。
研究方法
2.1 微生物、培养基与培养条件
以野生型产朊假丝酵母C. utilis CCTCC M 209298为亲本菌株（PS）。通过同源重组构建了三株工程菌：MET15敲除株（met15Δ）、MET15过表达株（MET15-OE）和MET15回补株（met15Δ::MET15）。
种子培养在500 mL锥形瓶中进行，含酵母提取物-蛋白胨-葡萄糖（YPD）培养基（20 g/L葡萄糖、10 g/L酵母提取物、20 g/L蛋白胨，pH 6.0），于30°C、200 rpm旋转摇床培养24 h。
摇瓶培养在发酵培养基（35 g/L葡萄糖、10 g/L (NH4)2SO4、12.3 g/L KH2PO4、0.05 g/L MgSO4，pH 5.0）中进行，相同温度和振荡条件下培养72 h。需要时，分别在0 h和15 h添加60 mmol/L L-甲硫氨酸和/或30 mmol/L L-半胱氨酸。
分批培养在5 L生物反应器（Minifors, Infors HT, Basel, Switzerland）中进行，将10%（v/v）种子培养液接种至3 L发酵培养基。生物反应器运行条件为30°C、350 rpm、通气量3 L/min。
补料分批培养在12 h至28 h期间采用多项式补料策略补加浓缩发酵培养基，总葡萄糖浓度设定为150 g/L。溶解氧水平使用Mettler-Toledo O2传感器（InPro6800/12/220, Greifensee, Zürich, Switzerland）实时监测，在补料分批培养期间通过手动调节搅拌速率（350–900 rpm）维持≥30%饱和度。
【数据】菌株：C. utilis CCTCC M 209298（PS）、met15Δ、MET15-OE、met15Δ::MET15；YPD培养基：20 g/L葡萄糖、10 g/L酵母提取物、20 g/L蛋白胨，pH 6.0；种子培养温度：30°C；转速：200 rpm；时间：24 h；发酵培养基：35 g/L葡萄糖、10 g/L (NH4)2SO4、12.3 g/L KH2PO4、0.05 g/L MgSO4，pH 5.0；摇瓶培养时间：72 h；L-甲硫氨酸添加量：60 mmol/L（0 h）；L-半胱氨酸添加量：30 mmol/L（15 h）；分批培养接种量：10%（v/v）；分批培养体积：3 L；分批培养温度：30°C；分批培养转速：350 rpm；通气量：3 L/min；补料时间：12–28 h；总葡萄糖浓度：150 g/L；溶解氧：≥30%饱和度；补料期搅拌速率：350–900 rpm
2.2 基因工程酵母菌株的构建
产朊假丝酵母CCTCC M 209298中MET15基因的遗传操作通过同源重组进行，方法如前所述。简言之，MET15敲除载体通过使用特异性引物（表S1）从C. utilis基因组中扩增MET15上下游各约500 bp的同源臂构建，以遗传霉素（G418）抗性基因作为筛选标记（图S1）。MET15过表达载体携带潮霉素B抗性基因（hyg），通过将MET15编码序列插入酵母表达载体pMD19T-18S构建，基因表达由GAPDH启动子驱动（图S2）。
随后，将重组载体与感受态酵母细胞（OD600 = 2.5）混合，转移至预冷的0.2 cm电击杯中。使用Gene Pulser Xcell系统（Bio-Rad, USA）在750 V和200 Ω条件下进行电穿孔。在含100 μg/mL G418的YPD平板上恢复生长的转化子命名为met15Δ，而在含100 μg/mL潮霉素B平板上生长的转化子定义为MET15-OE。对于MET15回补株（met15Δ::MET15），将过表达载体转化至met15Δ突变体，随后在潮霉素B平板上筛选。
所有阳性重组克隆通过菌落PCR验证（图S3–S5），敲除基因使用引物G418-F/R，过表达基因使用引物18S-F/R。酵母细胞形态在18 h时使用光学显微镜（Olympus BX53, Tokyo, Japan）在400×放大倍数下检查，并使用扫描电子显微镜（SEM）在3000×放大倍数下观察。SEM使用S-4800仪器（Hitachi, Japan）在15 kV加速电压下进行，冻干酵母细胞经金溅射处理。
【数据】同源臂长度：约500 bp；G418浓度：100 μg/mL；潮霉素B浓度：100 μg/mL；感受态细胞OD600：2.5；电击杯规格：0.2 cm；电穿孔电压：750 V；电阻：200 Ω；SEM加速电压：15 kV；SEM放大倍数：3000×；光学显微镜放大倍数：400×；形态观察时间：18 h
2.3 实时荧光定量PCR（qRT-PCR）检测
MET15基因的转录水平通过qRT-PCR使用表S2所列引物测定。总RNA提取、cDNA合成和PCR扩增按先前描述的方法进行。所有样品分析均设三个独立生物学重复，每个实验在96孔板（Bio-Rad）中重复三次。以ACT1基因作为内参进行归一化，相对基因表达采用2−ΔΔCt法计算。
【数据】生物学重复：3个；技术重复：3次；96孔板：Bio-Rad；内参基因：ACT1；计算方法：2−ΔΔCt法
2.4 无细胞提取液制备
取5 mL培养液在液氮中速冻10 min，随后在8,000 × g、4°C条件下离心10 min收集酵母细胞。湿细胞重悬于10 mL冰浴磷酸缓冲液（0.2 mol/L，pH 7.0）中，冰浴超声10 min。在12,000 × g、4°C条件下离心10 min去除细胞碎片后，收集上清液作为无细胞提取液，用于酶活性测定和胞内代谢物检测。
【数据】培养液取样量：5 mL；液氮速冻时间：10 min；离心条件：8,000 × g、4°C、10 min；重悬缓冲液：0.2 mol/L磷酸缓冲液，pH 7.0；重悬体积：10 mL；超声时间：10 min（冰浴）；二次离心条件：12,000 × g、4°C、10 min
2.5 酶活性测定
MAT活性参照Hu等（2009）的方法稍作修改进行测定。简言之，将1 mL反应液（20 mmol/L L-甲硫氨酸、20 mmol/L ATP、8 mmol/L GSH、20 mmol/L MgCl2、100 mmol/L KCl，pH 7.4）与1 mL无细胞提取液混合，37°C孵育60 min，加入0.5 mL 20%（v/v）高氯酸终止反应。一个单位（U）的MAT活性定义为每毫克蛋白质每分钟产生1 μmol SAM所需的酶量。
γ-GCS活性使用商业检测试剂盒（南京建成生物工程研究所，中国）按照制造商说明测定，基于340 nm处吸光度变化定量活性。一个单位的γ-GCS定义为在30°C下每分钟释放1 μmol Pi的酶量。
【数据】MAT反应液组成：20 mmol/L L-甲硫氨酸、20 mmol/L ATP、8 mmol/L GSH、20 mmol/L MgCl2、100 mmol/L KCl，pH 7.4；反应液体积：1 mL；无细胞提取液体积：1 mL；孵育温度：37°C；孵育时间：60 min；终止液：0.5 mL 20%（v/v）高氯酸；MAT单位定义：每毫克蛋白质每分钟产生1 μmol SAM；γ-GCS检测试剂盒：南京建成生物工程研究所；γ-GCS检测波长：340 nm；γ-GCS单位定义：30°C下每分钟释放1 μmol Pi
2.6 分析方法
胞内SAM和GSH分别使用0.35 mol/L H2SO4和40%（v/v）乙醇从湿酵母细胞中提取，方法如先前报道。细胞干重（DCW）通过将湿细胞沉淀在70°C下干燥至恒重测定。葡萄糖、SAM、GSH、L-甲硫氨酸、L-半胱氨酸、γ-谷氨酰半胱氨酸（γ-GC）、NADH、NAD+、ATP和ADP通过高效液相色谱（HPLC）定量。详细的色谱柱、流动相和操作参数列于表S3。
【数据】SAM提取液：0.35 mol/L H2SO4；GSH提取液：40%（v/v）乙醇；DCW干燥温度：70°C；检测方法：HPLC；检测物质：葡萄糖、SAM、GSH、L-甲硫氨酸、L-半胱氨酸、γ-GC、NADH、NAD+、ATP、ADP
2.7 动力学分析
动力学参数包括比细胞生长速率（μ）、比SAM产率（q P-SAM）、比GSH产率（q P-GSH）、生物量、SAM和GSH对葡萄糖的得率，以及生物量和SAM与GSH协同生产的产率，均按先前描述的方法计算。胞内SAM含量（ISC）和胞内GSH含量（IGC）按Wang等（2019）定义和计算。
【数据】动力学参数：μ、q P-SAM、q P-GSH、生物量得率、SAM得率、GSH得率、协同产率；ISC和IGC定义依据：Wang et al. (2019)
2.8 代谢通量分析
产朊假丝酵母中SAM和GSH生物合成途径关键代谢物的碳通量使用MATLAB 7.0（MathWorks, Natick, MA, USA）基于先前构建的代谢网络计算。代谢通量计算假设中间代谢物处于准稳态。
【数据】软件：MATLAB 7.0；假设条件：中间代谢物准稳态
2.9 统计分析
所有实验和生化测定均设三个重复。数据以平均值±标准差（SD）表示。使用SPSS 26（SPSS Inc., Chicago, IL, USA）进行双因素方差分析（ANOVA），随后进行Tukey事后检验以评估差异显著性，p ≤ 0.05视为统计学显著。
【数据】重复数：3；数据表示：平均值±SD；统计软件：SPSS 26；统计方法：双因素ANOVA + Tukey事后检验；显著性阈值：p ≤ 0.05
研究结果
3.1 MET15敲除、过表达和回补菌株的构建
针对MET15进行遗传操作，构建了产朊假丝酵母的基因敲除（met15Δ）、过表达（MET15-OE）和回补（met15Δ::MET15）菌株。通过菌落PCR（图S3–S5）和qRT-PCR（图S6）确认了成功构建和基因型验证。18 h培养物的光学显微镜（400×，图S7）和SEM（3,000×，图1）观察显示，改造菌株与PS之间无明显形态差异，表明MET15改造不改变产朊假丝酵母的核心形态特征，从而支持正常的发酵生理。
进行摇瓶培养以评估MET15操作对细胞生长及SAM和GSH生物合成的影响。如图2所示，met15Δ表现出严重缺陷：DCW、SAM和GSH水平分别降至PS的20.1%、9.7%和13.0%。相反，MET15-OE显示DCW略有改善（PS的104.4%），SAM（PS的143.7%）和GSH（PS的124.0%）积累显著增强。此外，met15Δ::MET15完全恢复了细胞生长及SAM和GSH的生物合成能力至PS水平。这些结果证实MET15是产朊假丝酵母中调控SAM和GSH生物合成的正调控因子，过表达有效强化了这些代谢物的协同生产。
为验证MET15敲除是否限制了胞内L-甲硫氨酸和L-半胱氨酸的供给，在发酵培养基中补充了单一或两种氨基酸（图3）。补充单一氨基酸部分恢复了met15Δ的细胞生长及SAM和GSH生物合成，但联合补充仅恢复至PS协同生产水平的约75%，表明内源性含硫氨基酸供给对细胞生长和代谢物生产至关重要。MET15-OE的遗传稳定性通过在种子平板上传代10代验证，每代在基本发酵培养基中培养。DCW、ISC和IGC在各代间保持一致（图S8），支持其适用于连续食品应用。
【数据】met15Δ的DCW：PS的20.1%；met15Δ的SAM：PS的9.7%；met15Δ的GSH：PS的13.0%；MET15-OE的DCW：PS的104.4%；MET15-OE的SAM：PS的143.7%；MET15-OE的GSH：PS的124.0%；联合补充氨基酸后met15Δ协同生产恢复水平：约PS的75%；遗传稳定性传代数：10代；形态观察时间：18 h；光学显微镜放大倍数：400×；SEM放大倍数：3,000×
3.2 产朊假丝酵母分批培养协同生产SAM和GSH
#### 3.2.1 分批过程与动力学分析
改造菌株和PS的分批培养在5 L搅拌发酵罐中进行。如图4所示，met15Δ表现出细胞生长微弱且SAM和GSH生物合成受限，而MET15-OE相比PS实现了更高的DCW和更优的SAM与GSH协同生产。met15Δ::MET15在生物量和产物积累方面表现出与PS高度一致的特征。
动力学参数（表1）显示，与PS相比，MET15-OE的DCW提高8.2%，SAM提高61.9%，GSH提高35.6%，SAM与GSH协同产量提高48.9%。其ISC（47.3%）、IGC（26.5%）、μ（3.3%）、q P-SAM（38.5%）、q P-GSH（56.1%）、SAM和GSH得率（54.4%）以及SAM和GSH产率（51.0%）均显著提升。这些发现表明MET15过表达促进了两种代谢物的单细胞生物合成能力，从而驱动SAM和GSH的最大化协同生产。
【数据】DCW提高：8.2%；SAM提高：61.9%；GSH提高：35.6%；协同产量提高：48.9%；ISC提高：47.3%；IGC提高：26.5%；μ提高：3.3%；q P-SAM提高：38.5%；q P-GSH提高：56.1%；SAM和GSH得率提高：54.4%；SAM和GSH产率提高：51.0%；发酵罐体积：5 L
#### 3.2.2 关键酶活性
MAT和γ-GCS分别是SAM和GSH生物合成的限速酶。如图5所示，MET15-OE在整个分批培养过程中维持了显著更高的MAT和γ-GCS活性，而met15Δ则表现出急剧下降（MAT：PS的23.0%；γ-GCS：PS的44.8%）。MET15-OE的平均MAT活性比PS高53.3%，平均γ-GCS活性高73.8%。met15Δ::MET15的酶活性与PS相当。这些结果证实MET15过表达增强了关键酶的活性，从而促进SAM和GSH的协同生产。
【数据】met15Δ的MAT活性：PS的23.0%；met15Δ的γ-GCS活性：PS的44.8%；MET15-OE平均MAT活性提高：53.3%；MET15-OE平均γ-GCS活性提高：73.8%
#### 3.2.3 胞内前体含量
SAM和GSH的生物合成依赖于含硫氨基酸前体的充足供给，包括L-甲硫氨酸、L-半胱氨酸和γ-GC。如图6所示，MET15-OE的胞内前体含量显著更高，而met15Δ在相同时间点的水平低于PS。在分批培养12 h至24 h期间，L-甲硫氨酸和L-半胱氨酸水平逐渐下降，这归因于它们被细胞代谢持续消耗，特别是用于SAM和GSH的生物合成。胞内γ-GC含量在18 h达到峰值后下降，表明其被高效转化为GSH。在18 h时，MET15-OE的L-甲硫氨酸比PS高6.5%，L-半胱氨酸高21.0%，γ-GC高37.3%，为增强SAM和GSH协同生产提供了坚实的物质基础。
【数据】18 h时MET15-OE的L-甲硫氨酸：比PS高6.5%；L-半胱氨酸：比PS高21.0%；γ-GC：比PS高37.3%；γ-GC峰值时间：18 h；前体下降时间段：12–24 h
#### 3.2.4 能量供给
SAM和GSH的生物合成是能量密集型过程，需要充足的ATP。如图7所示，MET15-OE的胞内NADH和ATP水平以及NADH/NAD+和ATP/ADP比值均显著高于PS（均在18 h达到峰值）。MET15-OE中升高的能量水平和增强的NADH与ATP再生支持了MAT和γ-GCS的催化，从而与前体充足供给协同驱动SAM和GSH的高效生产。相反，met15Δ表现出较低的胞内NADH和ATP水平，可能导致了其SAM和GSH协同生产的降低。
【数据】NADH和ATP峰值时间：18 h；MET15-OE的NADH、ATP、NADH/NAD+、ATP/ADP均显著高于PS
#### 3.2.5 代谢通量分析
为探究MET15操作对SAM和GSH生物合成途径中间代谢物的影响，计算了关键代谢物的碳通量并以葡萄糖消耗通量100进行归一化。鉴于12 h后各菌株在细胞生长和SAM、GSH生物合成方面的差异（图3），计算并比较了该时间点后的通量分布（表S4）。具体而言，MET15-OE将更高的通量导向甘氨酸（r25）、L-半胱氨酸（r26）、L-谷氨酸（r35）和L-甲硫氨酸（r44），将更多碳通量导入GSH（r62, r63）和SAM（r66）的生物合成，优于其他菌株。此外，构建了关键含硫代谢物的代谢通量分布流程图（图8），提供了MET15改造效应的全局视图。这些结果揭示MET15-OE增强了内源性含硫氨基酸供给，以支持改善的SAM和GSH协同生产。
【数据】归一化基准：葡萄糖消耗通量=100；通量计算时间点：12 h后；MET15-OE高流通量节点：甘氨酸（r25）、L-半胱氨酸（r26）、L-谷氨酸（r35）、L-甲硫氨酸（r44）；GSH合成通量：r62、r63；SAM合成通量：r66
3.3 补料分批培养中SAM和GSH的高效协同生产
为进一步提高SAM和GSH的协同生产，采用多项式补料策略对MET15-OE进行补料分批培养以实现高细胞密度。如图9所示，生物量在30 h迅速增至69.04 g/L，比PS高9.4%。SAM和GSH的积累持续至36 h，最终滴度分别为1,190.2 mg/L和1,052.5 mg/L，分别比PS高38.9%和58.7%。SAM和GSH的协同产量达到2,242.7 mg/L，比PS提高49.1%（表S5）。值得注意的是，虽然胞内SAM和GSH含量低于分批培养（表1），但生物量的显著增加驱动了SAM和GSH总协同产量的大幅提升。这些结果表明MET15过表达结合高密度培养是增强SAM和GSH协同生产的有效策略。
【数据】最高DCW：69.04 g/L（30 h）；DCW比PS提高：9.4%；SAM最终滴度：1,190.2 mg/L（36 h）；GSH最终滴度：1,052.5 mg/L（36 h）；SAM比PS提高：38.9%；GSH比PS提高：58.7%；协同产量：2,242.7 mg/L；协同产量比PS提高：49.1%
讨论与解读
SAM和GSH是广泛用作功能食品添加剂的高价值含硫生物活性化合物。在绿色生物合成路线中，食品级酵母菌株作为微生物细胞工厂优于化学合成途径。在食品生产的GRAS微生物中，酿酒酵母是SAM和GSH过量生产中使用最广泛的工程底盘，而产朊假丝酵母具有更优的细胞增殖能力、强大的无机硫同化能力且无致病风险，更适合SAM和GSH的大规模协同生产。
传统代谢操作研究仅优化工艺参数（如pH、溶解氧、碳源补料策略）或增加能量供给，未能从根本上解决上游含硫氨基酸生物合成通量的代谢瓶颈。本研究构建的MET15-OE工程菌为食品生物制造提供了两方面独特优势。第一，MET15的靶向改造不改变细胞微观形态，连续传代10代证实了稳定的遗传特性，满足连续工业应用对菌株稳定性的严格要求。第二，MET15-OE表现出增强的SAM和GSH生物合成能力，且无需外源添加氨基酸，降低了生产成本。
编译者解读：该研究选择MET15作为单一靶点进行代谢工程改造，策略简洁且效果显著——过表达使SAM和GSH协同产量在补料分批中提高49.1%，同时消除了外源氨基酸补加需求，在食品级发酵生产中具有成本优势。但单一基因过表达的提升幅度存在上限，未来可考虑与能量代谢或前体供给途径的多靶点协同改造，进一步释放产朊假丝酵母的合成潜力。
参考来源
期刊：Food Bioscience, 2026
DOI: 10.1016/j.fbio.2026.110031
DOI: 10.1016/j.fbio.2026.110031