来源：Structure-informed engineering of a laccase with enhanced catalytic activity and thermostability for facilitating lignocellulosic biomass saccharification（Bioresource Technology）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
木质纤维素是丰富的可再生原料，但木质素屏障严重制约其高效生物转化。漆酶能修饰木质素，却受限于热稳定性不足，难以适配高温生物炼制工艺。本研究以Bacillus aryabhattai TCCC 11368来源漆酶为对象，整合FireProt、PROSS与表面电荷工程三种计算策略进行理性设计。最优突变体S281E/N387D在60°C下半衰期提升3.7倍至330 min，催化效率（kcat/Km）提高35.4%。与纤维素酶联用处理小麦秸秆，还原糖产量达8.63 mg/mL，较野生型漆酶处理提高10.86%。
研究背景
木质纤维素生物质是可持续生产燃料和增值化学品的丰富可再生资源。但其高效生物转化受制于木质素形成的保护性基质——木质素包裹纤维素和半纤维素，限制酶的可及性。因此，高效修饰或去除木质素是提升生物质糖化效率的关键。
木质素是由对羟苯基（H）、愈创木基（G）和紫丁香基（S）单元通过多种醚键和碳碳键连接而成的复杂芳香聚合物，结构高度异质且顽固。传统物理化学方法（热化学、化学氧化）往往需要苛刻条件、高能耗或环境不友好的试剂。生物技术路线，尤其是酶法降解，则为木质素修饰和生物质 valorization 提供了温和可持续的替代方案。
在木质素降解酶中，漆酶（EC 1.10.3.2）作为一种广泛分布于真菌和细菌中的多铜氧化酶，因能以分子氧为电子受体氧化多种酚类化合物而备受关注。然而，漆酶的热稳定性有限，制约了其在高温度木质纤维素生物炼制过程中的应用。本研究采用整合计算工程策略，对来自Bacillus aryabhattai TCCC 11368的漆酶进行理性改造，以期同时提升其热稳定性和催化性能。
研究方法
2.1 质粒构建、转化与重组漆酶表达
漆酶基因序列（GenBank: MZ299025）从B. aryabhattai TCCC 11368基因组中扩增，所用引物列于表S1。PCR产物经DNA Gel/PCR Purification Miniprep Kit纯化后，通过同源连接插入经NcoI/XhoI双酶切的pET-28a(+)表达载体。重组质粒用T7启动子引物进行DNA测序验证，命名为pET28a-lac。确认后的质粒转化至Escherichia coli JM109进行质粒扩增，随后导入E. coli BL21(DE3)进行重组漆酶表达。DNA聚合酶和限制性内切酶购自Takara（大连，中国）。PCR引物由GENEWIZ（苏州，中国）合成。PCR产物凝胶提取和纯化试剂盒购自Omega Bio-Tek Inc.（GA，美国）。
重组漆酶表达时，携带pET28a-lac质粒的E. coli BL21(DE3)细胞在补充卡那霉素的Luria-Bertani（LB）培养基中于37 °C、200 rpm培养。当培养物OD600达到约0.6时，加入异丙基β-D-1-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）至终浓度0.4 mM诱导蛋白表达。诱导培养物在16 °C、120 rpm下继续过夜培养。离心收集细胞，沉淀重悬于裂解缓冲液（25 mM Tris-HCl，300 mM NaCl，20 mM咪唑，pH 8.0）。超声破碎（40%振幅，2 s脉冲/4 s暂停循环，总计20 min）。重组His标签漆酶（rLAC）通过镍亲和层析纯化。洗涤去除非特异性结合蛋白后，用含咪唑缓冲液洗脱目标蛋白。纯化酶通过超滤脱盐，使用磷酸缓冲液（50 mM，pH 8.0）去除残留咪唑。蛋白表达和纯度通过SDS-PAGE分析。纯化漆酶浓度使用二辛可宁酸（BCA）蛋白检测试剂盒（Solarbio，北京，中国）测定，以牛血清白蛋白（BSA）为标准品。
【数据】基因：漆酶（GenBank: MZ299025）；载体：pET-28a(+)；感受态细胞：E. coli JM109、E. coli BL21(DE3)；培养基：LB；抗生素：卡那霉素；诱导剂：IPTG 0.4 mM；诱导温度：16 °C；诱导转速：120 rpm；超声条件：40%振幅，2 s脉冲/4 s暂停，20 min；裂解缓冲液：25 mM Tris-HCl，300 mM NaCl，20 mM咪唑，pH 8.0；脱盐缓冲液：50 mM磷酸缓冲液，pH 8.0
2.2 酶学性质与稳定性分析
漆酶活性通过分光光度法监测2,2′-联氮-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)（ABTS）在420 nm处的氧化（ε420 = 36,000 M⁻¹ cm⁻¹）。除另有说明外，反应体系（240 μL）包含200 μL 0.1 M柠檬酸-磷酸缓冲液（pH 5.0）补充5 mM CuSO₄、30 μL 50 mM ABTS（终浓度6.25 mM）和10 μL适当稀释的酶液。漆酶活性最适pH使用0.1 M柠檬酸-磷酸缓冲液（pH 3.0–7.0）和0.1 M Tris-HCl缓冲液（pH 8.0–9.0）测定。最适温度在60–100 °C范围内评估。金属离子（K⁺、Ca²⁺、Mn²⁺、Cu²⁺、Mg²⁺、Zn²⁺、Fe³⁺、Fe²⁺、Co²⁺和Ni²⁺）在终浓度1和5 mM下的影响也被研究。热稳定性通过在50–80 °C孵育后评估，pH稳定性通过在pH 5.0、7.0和9.0缓冲液中孵育后评估。各条件下残余活性用标准活性 assay 测定。一单位（U）漆酶活性定义为在指定 assay 条件下每分钟氧化1 μmol ABTS所需的酶量。
【数据】底物：ABTS；检测波长：420 nm；ε420 = 36,000 M⁻¹ cm⁻¹；反应体系：240 μL（200 μL缓冲液+30 μL ABTS+10 μL酶液）；缓冲液：0.1 M柠檬酸-磷酸（pH 5.0），补充5 mM CuSO₄；ABTS终浓度：6.25 mM；pH范围：3.0–9.0；温度范围：60–100 °C；金属离子浓度：1和5 mM；热稳定性温度：50–80 °C；pH稳定性：5.0、7.0、9.0
2.3 酶动力学参数测定
酶动力学参数在2.2节确定的最适反应条件下测定。初始反应速率使用浓度范围1.25至6.25 mM的ABTS测定。动力学参数包括米氏常数（Km）、最大反应速率（Vmax）、转换数（kcat）和催化效率（kcat/Km），通过Lineweaver–Burk图计算。
【数据】底物浓度范围：1.25–6.25 mM ABTS；计算方法：Lineweaver–Burk图；参数：Km、Vmax、kcat、kcat/Km
2.4 漆酶计算分析与分子动力学模拟
漆酶三维结构使用AlphaFold2预测，ABTS三维结构从ChemSpider数据库获取。分子对接使用AutoDock Vina 1.5.6进行。对接中心设定为位于漆酶催化位点的立方盒子，边长20 Å（每格点1 Å）。通过评估几何取向和计算的对接结合能选择最可能的结合构象。对应最低对接能的最优结果用于后续结构分析和PyMOL 2.4.1可视化。WT和S281E/N387D变体的底物结合口袋体积使用PockDrug服务器计算。WT和S281E/N387D系统在正交模拟盒子中溶剂化，溶剂缓冲层10 Å，使用SPC/E水模型。加入抗衡离子（Na⁺和Cl⁻）中和系统。MD模拟在353 K进行，对应实验确定的工程漆酶最适催化温度，代表功能相关操作条件。温度和压力分别使用Nosé–Hoover链恒温器（1.0 ps弛豫时间）和Martyna–Tobias–Klein恒压器（1 bar，各向同性耦合，2.0 ps弛豫时间）控制。采用RESPA多时间步积分器，键合、短程和长程相互作用时间步分别为2.0、2.0和6.0 fs。长程静电相互作用使用光滑粒子网格Ewald方法计算，非键相互作用截断值9 Å。氢键相互作用基于几何标准分析，氢键定义为氢-受体距离小于2.5 Å且供体-氢-受体角度大于90°。系统平衡后，每个系统进行100 ns生产模拟。
【数据】结构预测：AlphaFold2；对接软件：AutoDock Vina 1.5.6；对接盒子：边长20 Å；模拟温度：353 K；水模型：SPC/E；溶剂缓冲：10 Å；恒温器：Nosé–Hoover链（1.0 ps）；恒压器：Martyna–Tobias–Klein（1 bar，2.0 ps）；时间步：键合2.0 fs，短程2.0 fs，长程6.0 fs；非键截断：9 Å；氢键标准：H-受体距离<2.5 Å，供体-H-受体角度>90°；生产模拟时长：100 ns
2.5 突变设计策略与筛选
漆酶突变体使用整合计算流程设计，结合FireProt 2.0、PROSS和Rosetta_supercharge。首先使用FireProt 2.0和PROSS基于互补计算策略预测稳定化突变，而Rosetta_supercharge用于识别可能改善蛋白热稳定性的表面电荷替换。三种方法产生的候选突变随后进行比较和结构分析，再进行实验验证。所选突变通过基于PCR的定点突变引入，相应引物列于表S2。
【数据】计算工具：FireProt 2.0、PROSS、Rosetta_supercharge；突变引入方法：PCR定点突变；引物：表S2
2.5.1 在线计算服务器
漆酶模型提交至FireProt 2.0和PROSS在线服务器进行突变设计。对于FireProt 2.0，使用BLAST E值截止1 × 10⁻¹⁰、最大200条序列、序列一致性范围30–90%构建序列数据集。FireProt 2.0使用三种不同策略生成突变设计：进化保守（Consensus）、预测自由能变化（Energy low risk和Energy high risk）以及混合组合方法，产生突变位点和残基类型的具体推荐。对于PROSS，采用默认设置，包括BLASTp E值阈值1 × 10⁻⁴、最大4000条同源序列和Rosetta Talaris 2014能量函数。生成了九个突变设计（design1–design9），氨基酸替换数量逐步增加。FireProt 2.0和PROSS一致预测的残基被视为高置信度候选，这些残基位点涉及的所有突变选项均被选入后续分析。
【数据】FireProt 2.0参数：BLAST E值≤1 × 10⁻¹⁰，最大序列数200，序列一致性30–90%；PROSS参数：BLASTp E值≤1 × 10⁻⁴，最大同源序列4000，能量函数Rosetta Talaris 2014；PROSS设计数：9个（design1–design9）
2.5.2 本地计算服务器
Rosetta Supercharging算法通过Rosetta Online Server的Supercharge模块应用，以优化表面电荷……
【数据】原文未详述
研究结果
3.1 rLAC的酶学特征
来自B. aryabhattai TCCC 11368的漆酶成功在E. coli BL21(DE3)中表达并纯化至均一，经SDS-PAGE确认。纯化的重组酶以下称为rLAC。rLAC活性的温度依赖性在0.1 M柠檬酸-磷酸缓冲液（pH 5.0）中以ABTS为底物，在60–100 °C温度范围内评估。如图1a所示，rLAC在80 °C表现出最大催化活性，其活性随温度升高至该最适点后，在更高温度下急剧下降。热稳定性实验显示，rLAC在50 °C孵育2 h后保留83.1%的初始活性，表明中等热稳定性。然而，在60 °C以上活性迅速下降，在70–80 °C孵育的前20 min内观察到活性显著丧失（图1b）。rLAC的最适温度（80 °C）高于几种已报道的细菌漆酶，如来自B. subtilis（55 °C）和B. licheniformis（40 °C）的漆酶。这些比较表明，rLAC在已表征的细菌漆酶中具有相对较高的温度催化偏好。此外，其热行为与几种真菌漆酶相当或更高，如来自Trametes versicolor的漆酶在50 °C以下保持稳定，但在70 °C迅速完全失活。
rLAC活性的pH依赖性在其最适温度（80 °C）下、pH 3.0–7.0范围内测定。酶在pH 5.0显示最大活性，在pH 6.0保留超过50%活性，而在更碱性条件下活性急剧下降（图1c）。pH稳定性实验表明，rLAC在pH 7.0、4 °C孵育10天后保留完全或略微增强的活性（>100%）。这种表观激活可能与中性条件下缓慢的构象重排或改善的铜配位有关。此外，rLAC在pH 5.0孵育10天后保留40%的初始活性，表明其在弱酸性条件下的稳健性。金属离子对rLAC活性的影响呈浓度依赖性（图1e）。在1 mM时，Cu²⁺显著增强酶活性，与其作为多铜氧化酶必需辅因子的角色一致。在5 mM时，Cu²⁺、Zn²⁺、Fe³⁺和Ni²⁺仍表现出激活效应，而Ca²⁺、Mg²⁺和Co²⁺显示可忽略或抑制效应。K⁺、Mn²⁺和Fe²⁺在两种测试浓度下均抑制酶活性，与先前对Bacillus thuringiensis漆酶的观察一致。与B. safensis S31漆酶在1 mM Mn²⁺存在下仅保留13.2%活性相比，rLAC在相同条件下表现出更高的残余活性（33%），表明对某些抑制性金属离子的耐受性改善。此外，rLAC活性对低盐浓度有中等耐受性，但在高盐度下被强烈抑制（图1f）。酶在NaCl浓度高达10 mM时保留超过80%活性，而在100 mM以上活性急剧下降，在1 M NaCl时几乎完全丧失。
【数据】最适温度：80 °C；50 °C孵育2 h残余活性：83.1%；最适pH：5.0；pH 6.0残余活性：>50%；pH 7.0孵育10天残余活性：>100%；pH 5.0孵育10天残余活性：40%；1 mM Cu²⁺：激活；5 mM Cu²⁺/Zn²⁺/Fe³⁺/Ni²⁺：激活；1 mM Mn²⁺残余活性：33%（对比B. safensis S31：13.2%）；10 mM NaCl残余活性：>80%；100 mM NaCl以上：急剧下降；1 M NaCl：几乎完全丧失
这些发现表明，对于工业应用，rLAC的性能可通过在其稳定温度（约60 °C）和弱酸性pH范围（5.0–6.0）下操作来优化，同时避免抑制性金属离子包括Mn²⁺和Fe²⁺。其在中性条件下的稳定性也为工艺整合提供了灵活性。总体而言，与几种已报道的细菌和真菌漆酶相比，rLAC表现出相对较高的最适温度和广泛的pH适应性，尽管其在高温下的操作稳定性仍然有限。这些性质表明rLAC是温和至中等条件下木质纤维素相关反应的有前景的生物催化剂。然而，其有限的热稳定性制约了其在高温度生物质转化过程中的应用。鉴于高效的木质纤维素糖化需要在高温下持续酶活性，因此需要旨在改善热稳定性的工程策略来增强其工业适用性。
【数据】推荐操作温度：约60 °C；推荐pH范围：5.0–6.0；抑制性金属离子：Mn²⁺、Fe²⁺
3.2 rLAC的计算机辅助理性重设计以改善稳定性和催化活性
尽管rLAC在80 °C表现出最大催化活性，但其在高温下的有限稳定性限制了实际应用。为同时改善热稳定性并保持催化活性，采用了结合稳定性导向预测和表面电荷工程的计算突变设计策略。首先使用FireProt 2.0和PROSS通过互补的基于能量和进化的分析识别具有潜在稳定效应的突变。按照FireProt工作流程，仅保留预测折叠自由能变化（ΔΔG）低于−1.5 kcal mol⁻¹的突变，因为该阈值已被证明能有效富集强稳定化替换同时减少假阳性预测。FireProt初步预测79个候选突变，而PROSS识别11个适合稳定化替换的残基位点。为提高预测可靠性，仅保留两种算法独立识别的残基位点作为共识候选。随后，将FireProt或PROSS在这些共识位点提出的所有氨基酸替换组合，产生26个候选突变用于实验评估：A73E、A73M、A73V、A73L、A73I、A146T、A146M、A146L、S180N、S180G、N396G、L267G、A271Y、A271F、A271I、A271L、F334P、N387E、N419Q、N419F、N419Y、T453V、T453M、T453I、T453L、R473I（图2a）。
并行地，使用Rosetta_supercharge进行表面电荷工程，以识别可通过改变蛋白表面静电性质增强热稳定性的替换。以目标净电荷−20，Rosetta_supercharge产生19个候选突变（R17E、Q126E、Q175D、K185D、S213D、S281E、F334D、Q340E、H349E、R352E、N356D、S369D、N387D、Q428E、Q461E、R492E、Y495D、S497D、N498E），对应计算最终净电荷−19（图2b）。经过结构检查以消除具有潜在空间冲突或靠近催化中心的突变后，从两种互补设计策略中共选择45个候选突变用于实验表征。WT重组漆酶（rLAC）和所有设计的变体在E. coli BL21(DE3)中异源表达、纯化，并初步在最适反应温度（80 °C）下筛选催化活性。表现出可接受催化性能的变体随后基于70 °C孵育60 min后的残余活性评估热稳定性。这种序贯筛选策略能够消除显著损害催化功能的突变，同时优先考虑稳定性改善的变体。如图2c所示，大多数突变对酶活性影响很小，而几个替换显著损害催化性能。相反，四个变体S281E、N387D、N419Q和N498E表现出显著高于WT酶的比活性，分别增加67.3%、26.8%、14.5%和10.9%。显示严重活性丧失的变体被排除进一步表征，剩余34个突变体进行热稳定性评估（图2d）。六个变体A73I、S281E、F334D、F334P、N387D和Y495D在热孵育后保留高于WT的残余活性。综合考虑催化活性……
【数据】FireProt ΔΔG阈值：<−1.5 kcal mol⁻¹；FireProt候选突变数：79；PROSS候选残基位点数：11；共识候选突变数：26；Rosetta_supercharge目标净电荷：−20；Rosetta_supercharge候选突变数：19；计算最终净电荷：−19；总候选突变数：45；筛选温度：80 °C；热稳定性评估条件：70 °C，60 min；比活性提升：S281E +67.3%，N387D +26.8%，N419Q +14.5%，N498E +10.9%；热稳定性改善变体：A73I、S281E、F334D、F334P、N387D、Y495D；剩余评估突变体数：34
3.3 分子动力学模拟与结构分析
【数据】原文未详述
3.4 漆酶对预处理小麦秸秆酶解特性的影响
【数据】原文未详述
讨论与解读
本研究成功应用整合FireProt、PROSS和表面电荷工程的计算蛋白工程流程，改善了细菌漆酶的热稳定性和催化性能，用于木质纤维素生物质糖化。在工程变体中，S281E/N387D表现出最佳综合性能，比活性提高35.4%，60 °C半衰期较WT酶延长3.7倍。分子建模和MD模拟表明，改善的热稳定性与氢键和盐桥形成增加、结构紧凑性增强以及表面静电分布优化有关，而催化效率的提升可能源于底物结合和活性位点可及性的有利变化。在优化糖化条件下，工程漆酶将预处理小麦秸秆的还原糖产量提高至8.63 mg/mL，较WT酶提高10.86%。总体而言，工程S281E/N387D变体代表了高温木质纤维素生物质转化的有前景候选，而整体工程流程可为其他工业酶的改造提供有用框架。未来研究应进一步评估其在实际工艺条件下的性能，包括高固含量 loading、长期运行和对木质纤维素衍生抑制剂的耐受性，并纳入直接……
编译者解读：该研究的亮点在于将三种互补计算策略串联使用——FireProt/PROSS负责核心稳定化，Rosetta_supercharge负责表面电荷优化，再以共识位点交叉验证降低假阳性。S281E/N387D双突变在60 °C下半衰期从约89 min提升至330 min，同时kcat/Km提高35.4%，说明热稳定性与催化活性并非必然权衡。但需注意，小麦秸秆糖化实验仅验证了还原糖总量，未区分漆酶处理对木质素去除与纤维素酶可及性的具体贡献，且高盐、高固含量等工业条件尚未考察。从合成生物学视角看，该计算流程的可迁移性比单一突变体更有价值。
参考来源
期刊：Bioresource Technology, 2026
DOI: 10.1016/j.biortech.2026.135474
DOI: 10.1016/j.biortech.2026.135474