深度学习辅助的全细胞生物传感器用于儿茶酚监测

来源：A Deep Learning-Assisted Whole-Cell Biosensor for Catechol Monitoring: Synergizing BphC Recognition with a Multi-Feature Fusion Vision Transformer（Talanta）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription

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导读

儿茶酚（Cat）的定量检测通常依赖台式仪器，限制了其在现场环境分析中的应用。本研究开发了一种便携式图像生物传感平台，将基因工程全细胞生物催化剂与多特征融合Vision Transformer（MF-ViT）相结合。研究构建了表达2,3-二羟基联苯-1,2-双加氧酶（BphC）的大肠杆菌菌株，可特异性将Cat转化为可测量的黄色产物。分子对接和分子动力学模拟为传感器的分析选择性提供了结构依据。MF-ViT模型在环境光照下实现了高预测精度（R²=0.944），线性范围为12.5–400 nM，检测限为1.66 nM。

研究背景

酚类化合物是工业废水中的主要有机污染物类别，来源于农药制造、制药生产和石油化工精炼等过程。儿茶酚（Cat，1,2-二羟基苯）因其毒性、环境持久性和潜在致癌性，被美国环境保护署和欧盟列为优先污染物。低浓度Cat可在水生环境中积累，对水生生物造成组织病理学损伤，并对人类构成神经毒性风险。因此，建立快速、灵敏、便携的Cat监测方法对环境风险评估至关重要。

传统分析方法包括高效液相色谱、气相色谱-质谱联用和电化学方法，虽能提供可靠精度，但往往需要专业仪器、繁琐的样品制备和较高的操作成本，限制了其频繁现场测量的适用性。全细胞生物传感器提供了一种有吸引力的替代方案。与纯化酶检测相比——后者常因稳定性有限和复杂基质中辅因子快速耗竭而受限——全细胞传感器受益于细胞内微环境，支持酶保护和辅因子持续再生。

研究方法

2.1 试剂与仪器

Cat及其结构类似物（4-甲基儿茶酚、间苯二酚、对苯二酚、4-硝基苯酚、2-硝基苯酚）购自上海麦克林生化科技有限公司。培养基组分（酵母提取物和胰蛋白胨）购自Thermo Fisher Scientific。氯化钠（NaCl）购自国药集团化学试剂有限公司（上海）。卡那霉素和异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）购自北京索莱宝科技有限公司。用于分子克隆的Phanta Max超保真DNA聚合酶购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司，基因组/质粒DNA提取试剂盒购自天根生化科技（北京）有限公司。限制性内切酶（BamH I和EcoR I）及T4 DNA连接酶购自Thermo Fisher Scientific。所有引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。除非另有说明，所有试剂均为分析纯，溶液使用超纯水配制。吸光度使用NanoPhotometer N50 Touch分光光度计（德国）测定。用于构建初始深度学习图像数据集时，比色图像使用iPhone 13智能手机（2532 × 1170像素）在环境室内光照下拍摄，未使用定制暗箱配件。为模拟真实便携使用场景同时保持几何一致性，离心管水平放置于覆盖白色A4纸的实验室台面上，以提供均匀背景。图像采集时智能手机平行于离心管水平面，垂直距离约15 cm，从正上方直接拍摄样品。智能手机相机使用默认自动对焦、自动曝光和自动白平衡模式。此外，为验证跨设备可靠性，随后由不同操作人员使用Xiaomi 13和realme GT Neo6智能手机在相同环境条件下采集独立测试集。模型训练和验证在配备NVIDIA GeForce RTX 3060 GPU（12 GB显存）的工作站上进行。算法使用PyTorch在Python 3.8中实现，以确保计算可重复性。

【数据】试剂：Cat及5种结构类似物；培养基组分：酵母提取物、胰蛋白胨；抗生素：卡那霉素；诱导剂：IPTG；限制性内切酶：BamH I、EcoR I；连接酶：T4 DNA Ligase；DNA聚合酶：Phanta Max Super-Fidelity；图像采集设备：iPhone 13（2532×1170像素）、Xiaomi 13、realme GT Neo6；拍摄距离：约15 cm；GPU：NVIDIA GeForce RTX 3060（12 GB VRAM）；Python版本：3.8；原文未详述各试剂具体用量

2.2 重组菌株的构建

使用表S1所列引物，通过PCR从恶臭假单胞菌基因组DNA中扩增全长bphC基因。纯化的PCR产物和pET28a(+)表达载体经BamH I和EcoR I双酶切后连接，生成重组质粒pET28a-bphC。该构建体通过热激法转化至化学感受态大肠杆菌BL21 (DE3)细胞中。阳性克隆首先通过菌落PCR初步筛选，进一步通过DNA测序确认。为评估异源表达，重组菌株培养至指数期，在25°C下用0.5 mM IPTG诱导16小时。通过12%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分析蛋白表达。

【数据】菌株：大肠杆菌BL21 (DE3)；质粒：pET28a-bphC；诱导剂浓度：0.5 mM IPTG；诱导温度：25°C；诱导时间：16 h；SDS-PAGE凝胶浓度：12%；酶切位点：BamH I、EcoR I；原文未详述PCR扩增条件

2.3 分子对接与分子动力学模拟

为研究分子识别机制并为结构选择性提供理论基础，使用SWISS-MODEL服务器通过同源建模生成受体模型（表S2，图S1）。Cat结构使用ChemDraw 18.1和Chem3D构建。分子对接使用AutoDock Tools 1.5.6进行，结合姿势使用PyMOL和Discovery Studio 2019分析。MD模拟在GROMACS 2022中进行。蛋白质使用AMBER14SB力场。配体参数使用sobtop_1.0 (dev3.1)基于GAFF2生成，并分配RESP电荷。复合物在立方盒中使用TIP3P水[28]溶剂化，并离子化至0.15 M NaCl以中和系统。长程静电作用采用Particle Mesh Ewald（PME）方法处理，共价键约束使用LINCS算法施加。能量最小化分两阶段进行，生产模拟在NPT系综下（310 K，1 bar）进行100 ns。结合自由能通过g_mmpbsa使用MM-PBSA方法估算，以识别负责靶标螯合的关键残基。

【数据】软件：SWISS-MODEL、AutoDock Tools 1.5.6、PyMOL、Discovery Studio 2019、GROMACS 2022、sobtop_1.0 (dev3.1)；力场：AMBER14SB（蛋白）、GAFF2（配体）；水模型：TIP3P；离子浓度：0.15 M NaCl；静电方法：PME；约束算法：LINCS；模拟温度：310 K；压力：1 bar；模拟时长：100 ns；结合自由能方法：MM-PBSA（g_mmpbsa）

2.4 全细胞生物传感器的构建

重组大肠杆菌菌株在补充卡那霉素的LB培养基中培养至OD600为0.6，随后进行IPTG诱导。通过离心收获细胞，并用磷酸盐缓冲液（PBS，pH 7.4）彻底洗涤。通过标准平板计数法测定活细胞数，以标准化生物催化剂剂量。基于优化实验，所有后续检测使用3×10¹¹ CFU/mL的工作悬浮液。对于Cat检测，将细胞悬浮液等分试样与Cat标准品或加标环境水样混合，在25°C下孵育20分钟。通过记录可见颜色变化并测量375 nm处吸光度（OD375）来评估酶促信号生成。

【数据】培养基：LB + 卡那霉素；诱导时OD600：0.6；缓冲液：PBS，pH 7.4；工作细胞浓度：3×10¹¹ CFU/mL；孵育温度：25°C；孵育时间：20 min；检测波长：375 nm

2.5 多特征融合Vision Transformer模型的构建

为从智能手机图像中解码光学值，开发了一个结合ViT全局处理能力与标准比色参数（OD375）的深度学习框架。分析流程包括四个连续步骤：(i) 几何区域选择，(ii) 统计颜色特征提取，(iii) 深度视觉表示学习，(iv) 多特征融合回归输出。

#### 2.5.1 基于几何先验的ROI选择与数据预处理

为分离信息性显色信号，采用感兴趣区域（ROI）选择程序。图像空间（高度，宽度）被划分为溶液区域（）和背景区域（）。定义为图像下部的中心带，公式如式(1)所示：(1) 其中和分别表示垂直和水平坐标。经验参数设为。定义为上部与外围边缘的并集，如式(2)所述：(2) 其中，，，且。对于模型开发，主要数据集使用6个Cat浓度梯度下的12个生物学重复构建。每个样品在不同角度和环境光照下拍摄10张图像，产生720张图像的初始数据集。这些图像随机分为训练集（70%）、验证集（15%）和测试集（15%）。为提高泛化能力，标准数据增强（旋转、仿射缩放和亮度扰动）仅应用于训练集，将其扩展至2,520张图像。

【数据】ROI：溶液区域+背景区域；生物学重复：12个；浓度梯度：6个；每样品图像数：10张；初始数据集：720张；训练/验证/测试比例：70%/15%/15%；数据增强后训练集：2,520张；增强方法：旋转、仿射缩放、亮度扰动

#### 2.5.2 多维比色特征工程

计算一组标准比色特征（）以表示宏观显色反应。首先，通过RGB转换系数计算逐像素亮度，如式(3)所示：(3) 计算溶液与背景区域之间的差分亮度对比度（）以衰减一般照明偏差，如式(4)所示：(4) 通道差分色度对比度（）按式(5)计算：(5) 此外，将图像转换至HSV空间以提取平均饱和度（）和明度（），及其区域对比度（，）。这些标量拼接为14维统计特征向量，如式(6)所示：(6)

【数据】统计特征向量维度：14维；特征类型：亮度、差分亮度对比度、RGB通道差分色度对比度、HSV空间饱和度/明度及其区域对比度

#### 2.5.3 Vision Transformer架构与特征融合

使用ViT-B/16架构[27]作为视觉骨干。图像调整至224×224像素，并分割为非重叠的16×16图块。经堆叠的Transformer编码器块处理后，从分类标记（）获得深度视觉表示（）。采用后期融合策略整合表示，如式(7)所示：(7) 融合向量输入多层感知机（MLP）回归头以生成预测的OD375值（记为），如式(8)计算：(8)

【数据】架构：ViT-B/16；输入尺寸：224×224像素；图块大小：16×16；融合策略：后期融合；回归头：MLP

#### 2.5.4 优化（原文此处中断）

研究结果

3.1 基于Vision Transformer的全细胞生物传感器原理

集成生物传感平台的操作框架如图5所示。该平台结合基因工程全细胞生物催化剂与多特征融合深度学习模型，实现Cat的定量监测。如图5A所示，生物识别模块利用恶臭假单胞菌的芳香族降解途径[30]。编码外二醇双加氧酶BphC的bphC基因在大肠杆菌BL21中异源表达，作为特异性传感元件。暴露后，细胞内BphC催化芳环的间位裂解，将无色Cat底物转化为黄色产物HODA[11,12]。产生的光学强度呈浓度依赖性增加，提供可测量的显色信号。与纯化酶检测相比，这种全细胞配置利用细胞内微环境保护酶并支持必要的辅因子再生，从而增强生物识别模块的操作稳定性。

为将这种生化颜色变化通过智能手机成像转化为定量读数，开发了MF-ViT模型（图5B）。传统简单智能手机RGB提取仍易受环境光照变化和相机特定参数的影响。在本框架中，生物传感图像解释被公式化为多维回归问题。首先，利用几何先验分割ROI，将样品反应区与背景分离。随后，应用双路径特征提取策略。计算统计特征向量（）以捕获领域相关的比色属性（如亮度对比度和RGB/HSV差分），从而将基本光学原理整合到网络中。同时，ViT骨干从图像图块中提取全局语义表示（）。通过采用自注意力机制，ViT架构有效捕获长程空间依赖关系和图像整体上下文，与依赖局部感受野的标准CNN相比提供了独特方法。最终，这些特征通过后期融合策略（）拼接，并由MLP回归器处理以预测光学值。该架构将特定生物信号生成与算法驱动的数字解码相桥接，促进跨不同成像设备的可靠定量分析。

【数据】菌株：大肠杆菌BL21；基因：bphC；酶：BphC（外二醇双加氧酶）；底物：Cat；产物：HODA（黄色）；模型：MF-ViT；特征融合策略：后期融合

3.2 表达BphC的基因工程菌株构建

生物传感元件的开发始于来自恶臭假单胞菌的bphC基因，该基因编码负责芳环裂解的外二醇双加氧酶BphC（图1A）。以恶臭假单胞菌基因组DNA为模板，扩增bphC片段，在约900 bp处产生明显产物，与其理论长度897 bp一致。随后构建重组质粒pET28a-bphC并转化至大肠杆菌BL21 (DE3)（图1B）。IPTG诱导后，粗裂解液的SDS-PAGE分析显示在约40 kDa处有明显蛋白条带（图1C）。随后通过Ni-NTA亲和层析（使用250 mM咪唑洗脱）纯化，在预期分子量处获得目标蛋白（图1D），确认BphC的成功异源表达和分离。

为确定最有效的分析形式，在三种生物催化制剂中评估催化活性：完整全细胞、粗细胞裂解液和纯化酶。如图1E和F所示，完整全细胞悬浮液表现出最强的光学响应，在加入Cat后产生明显的黄色并在OD375处快速增加。相反，粗裂解液显示边际活性，而纯化酶在测试条件下表现出极低的催化活性。这种性能差异与BphC的结构特征一致，BphC是一种非血红素铁(II)依赖性双加氧酶[31]。在体外，Fe(II)中心极易氧化为Fe(III)或从活性位点解离，导致酶快速失活[32,33]。相比之下，全细胞基质的细胞内还原环境保护关键金属并促进持续催化周转。因此，选择全细胞形式用于后续传感应用。使用该全细胞系统，在宽Cat浓度范围（10 nM至10 mM）内进一步表征光学响应。如图1G和H所示，在0 nM至1 mM范围内，可见颜色强度和OD375值均表现出明显的剂量依赖性增加。在10 mM极端浓度下观察到信号降低，可能归因于底物诱导的细胞毒性或严重代谢负担。尽管如此，在最佳响应范围内，工程菌株有效地将靶标识别转化为可量化的光学输出。虽然这些宏观生化结果证明了生物传感器的可行性，但在原子水平表征特定酶-底物相互作用对于从理论上合理解释其内在亲和力和靶标选择性仍然至关重要。

【数据】基因长度：897 bp（凝胶显示约900 bp）；蛋白分子量：约40 kDa；洗脱液：250 mM咪唑；Cat浓度范围：10 nM–10 mM；线性响应范围：0 nM–1 mM；检测波长：OD375；诱导剂：IPTG

3.3 分子对接与分子动力学模拟

首先进行分子对接以检查Cat在BphC中的结合构型。Cat定位在疏水口袋内，估计最低结合能为–4.94 kcal/mol（图2A，图S2）。底物的羟基与ARG98和SER121形成氢键（1.7–3.2 Å，图2B）。此外，芳环参与π相互作用，包括与ARG46的π-阳离子相互作用、与TYR117的π-π堆积以及与ALA47的π-烷基接触（图S3）。为评估该复合物的动态稳定性，进行了100 ns MD模拟。均方根偏差（RMSD）在40 ns后稳定在约2 Å（图2C）。结合口袋残基的均方根涨落（RMSF）值保持在3 Å以下（图2D），表明局部柔性受限。溶剂可及表面积（SASA，图2E）和回转半径（Rg，图2F）保持相对恒定，表明配体结合未破坏整体蛋白构象。氢键分析显示整个轨迹中平均有两个持续性氢键（图2G），与涉及ARG98和SER121的相互作用一致（图S3）。此外，自由能景观（FEL，图2H）显示局部低能盆地，支持结合态的稳定性。MM-PBSA计算得出估计结合自由能（ΔG_bind）为–17.74 kcal/mol（图2I）。残基能量分解确定TRP48、ARG46、ALA47、TYR117、ARG49和ALA120为主要能量贡献者（图2J）。ARG46、ALA47和TYR117在对接和MD分析中均参与，支持其在锚定芳环中的作用。这些计算结果为传感器的分析选择性提供了结构依据。疏水口袋的几何形状以及与ARG98和SER121的氢键表明，底物需要邻位羟基才能达到催化裂解所需的取向[34]。这种结构要求限制间位或对位取代的酚类类似物形成活性复合物，从而最小化潜在交叉反应性。这些特定分子相互作用构成了特异性生化信号的基础，随后由基于图像的深度学习模型进行量化。

【数据】最低结合能：–4.94 kcal/mol；氢键距离：1.7–3.2 Å；氢键残基：ARG98、SER121；π相互作用残基：ARG46（π-阳离子）、TYR117（π-π堆积）、ALA47（π-烷基）；RMSD稳定值：约2 Å（40 ns后）；RMSF：<3 Å；MD模拟时长：100 ns；平均氢键数：2个；ΔG_bind：–17.74 kcal/mol；关键能量残基：TRP48、ARG46、ALA47、TYR117、ARG49、ALA120

3.4 通过MF-ViT深度学习模型的信号解码

便携式比色生物传感中反复出现的限制是依赖……（原文此处中断）

讨论与解读

本研究提出了一种全细胞生物传感方法，结合深度学习模型用于Cat定量。表达BphC的工程大肠杆菌菌株用于产生对Cat的剂量依赖性比色响应。MD模拟表明，BphC活性位点的双齿氢键要求和空间约束限制了结构类似物的结合，与观察到的传感器选择性一致。对于环境光照下的信号分析，应用了MF-ViT模型。通过结合统计比色特征与视觉表示，该模型减少了简单RGB分析中常见的由光照变化引起的预测误差。该方法提供了1.66 nM的检测限，并在三种智能手机设备上保持了预测准确性。加标海水和自来水样品中测定的Cat浓度与标准分光光度法获得的结果一致。这些结果证明了将全细胞生物催化与基于图像的深度学习相结合用于环境目标分子定量分析的可行性。

编译者解读：该研究的方法学亮点在于"生物识别+算法解码"的协同设计——BphC的底物特异性由结构生物学计算预先验证，而非仅凭实验试错；MF-ViT将光学先验知识（比色统计特征）嵌入深度网络，降低了对成像条件的苛求。其局限在于：检测范围（12.5–400 nM）与真实环境浓度分布的匹配度尚需更多现场样本验证；全细胞体系在复杂基质中的长期稳定性未在节选中充分展示。对合成生物学而言，该范式提示：未来可将传感元件与信号处理算法作为整体进行协同优化，而非各自独立开发。

参考来源

期刊：Talanta, 2026

DOI: 10.1016/j.talanta.2026.130638

DOI: 10.1016/j.talanta.2026.130638