来源：Comparative Aspergillus niger-mediated bioleaching and recovery of heavy metals from multi-source sludge: Towards circular bioeconomy driven sludge management（Journal of Water Process Engineering）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
城市污泥与工业污泥中的重金属污染是制约污泥土地利用的关键瓶颈。本研究以黑曲霉（Aspergillus niger）为生物浸出菌株，系统比较了生活污水处理厂（DSTP）、市政污水处理厂（MSTP）和制革厂共用废水处理厂（CETP）三种污泥的重金属去除效果。在优化条件下（2×10⁷ 孢子/mL；1.5% w/v 固体），MSTP与DSTP污泥第11天对Cu、Fe、Zn的去除率分别达66.3–72.7%、69.9–73.5%、78.9–85.3%；难处理的CETP污泥第13天峰值效率为Cu 49.6%、Fe 61.5%、Zn 72.6%。处理后污泥中残余重金属浓度均低于印度标准限值，硫化钠沉淀可实现约35–69%纯度的金属回收。
研究背景
全球污水处理厂每年产生大量剩余污泥。市政与工业污泥的全球年产量分别达4500万吨干重和4620亿吨。预计到2050年，全球污泥干固体产量将从当前的4500万吨激增至6800万吨，高效管理的需求愈发迫切。污泥成分复杂，含有机物、无机物、药物及个人护理品等新兴污染物、病原微生物和有毒重金属。
印度皮革产量达20亿平方英尺，每天产生54 kg制革铬废物。印度超过70%的制革企业集中在孟买、德里、加尔各答、坎普尔和钦奈等地区。泰米尔纳德邦的Dindigul、Vellore和Kancheepuram地区地下水中重金属浓度已超过印度标准局（BIS）限值。环境基质中高浓度重金属会引发植物毒性——根系伸长受阻、种子萌发受抑、叶绿素降解，最终降低生物量积累和作物产量。未经处理的污泥施用于土地时，重金属可通过多种途径进入食物链，威胁植物、动物和人类健康。
传统酸浸法受限于强金属-有机络合作用，处理效率有限。本研究提出将pH依赖的硫化物溶解度与真菌代谢策略性耦合，并针对文献中鲜有探索的危险制革废物进行关键参数优化。
研究方法
2.1 材料
#### 2.1.1 污泥样品
原始DSTP和MSTP污泥样品采集自我们前期工作中使用的同一集中式设施[18]。工业污泥样品取自印度泰米尔纳德邦Ranipet的Ranitec CETP离心机组。虽然这些原始污泥（RS）基质的基础理化表征已在前人研究中建立，但本研究引入了完全不同的生物处理范式（通过黑曲霉的真菌代谢而非细菌硫氧化），并将评估扩展至高度危险的工业制革污泥。新鲜污泥样品在使用前储存于4 °C冰箱中。
【数据】样品来源：DSTP、MSTP（同一集中式设施）、CETP（Ranitec, Ranipet, Tamil Nadu, India）；储存温度：4°C；原文未详述污泥采集量
#### 2.1.2 酸性土壤的采集与制备
富含腐烂有机物和落叶的土壤采集自印度泰米尔纳德邦钦奈IITM生物技术二号楼附近的花园区。为确保有利于嗜酸性真菌生长的持续酸性条件，土壤定期用酸性含金属废水（pH ~0.9）改良，该废水采集自IITM化学系材料科学研究中心（MSRC）的电感耦合等离子体质谱（ICP–MS）设施。该废水具有低pH和含重金属的特征，模拟了与后续生物浸出应用相关的酸性和富金属环境。
【数据】土壤采集地点：IITM生物技术二号楼附近花园；改良液pH：~0.9；改良液来源：IITM MSRC ICP–MS设施；原文未详述土壤用量和改良频率
#### 2.1.3 碳底物的采购
为分离和培养嗜酸性真菌黑曲霉，从IITM校园购物中心（印度钦奈）采购了常见有机底物，包括白面包和棕面包、洋葱、葡萄和花生。
【数据】底物种类：白面包、棕面包、洋葱、葡萄、花生；采购地点：IITM校园购物中心；原文未详述各底物用量
#### 2.1.4 化学品与玻璃器皿
所用化学品包括蔗糖（98%）、酵母提取物（≥99%）、硝酸钠（NaNO₃）（98%）、磷酸二氢钾（KH₂PO₄）（≥98%）、七水硫酸镁（MgSO₄·7H₂O）（99.5–102%）、氯化钾（KCl）（≥99%）和马铃薯葡萄糖琼脂（PDA），均为分析纯，购自HiMedia、Avra、Emplura、Fisher Scientific和Rankem（印度）。所有其他化学品由Rankem（印度）提供。玻璃器皿购自Borosil（印度）。
【数据】蔗糖纯度：98%；酵母提取物纯度：≥99%；NaNO₃纯度：98%；KH₂PO₄纯度：≥98%；MgSO₄·7H₂O纯度：99.5–102%；KCl纯度：≥99%；供应商：HiMedia、Avra、Emplura、Fisher Scientific、Rankem；玻璃器皿供应商：Borosil
2.2 实验方法
#### 2.2.1 接种体制备、耐重金属真菌的回收及分子鉴定
嗜酸性黑曲霉的分离方法为：将有机底物（面包、洋葱、葡萄和花生）在无菌湿润袋中于30 °C孵育7天，其中花生显示出最高的产孢量。将真菌培养物转移至酸性土壤（pH 0.97，70 g）中1周以回收耐重金属菌株，随后在培养皿中于30 °C进行传代培养。初步筛选结合了宏观评估（特征性黑色分生孢子头）与子实体和菌丝的相差显微镜观察。为最终确认分类学身份，采用ITS rDNA测序进行分子鉴定（ABI 3730xl遗传分析仪上的循环测序试剂盒，所用引物：ITS1和ITS4）（补充文本S1）。所得序列（使用多序列比对软件Clustal W比对）基于核苷酸同源性和通过NCBI数据库BLAST的系统发育分析，与黑曲霉显示出99.49–99.66%的序列同一性匹配。确认的真菌分离株ITS rDNA序列已提交至NCBI GenBank数据库，登录号为PZ484815，系统发育树使用MEGA 7构建。孢子在花生和PDA（3.9% w/v）上进一步扩繁。孢子悬液的制备方法为：将PDA平板轻轻刮入20 mL Milli-Q水中。制备真菌孢子储备悬液后，进行系列稀释，随后在相差显微镜（Nikon Eclipse LV 100，日本）（5×放大）下使用血细胞计数板/Neubauer计数室（0.0025 mm²面积，0.1 mm深度；亮线型，HBG，德国）计数孢子[19]。真菌接种体制备时，将1.5 mL含2×10⁷孢子/mL的孢子悬液接种至250 mL Erlenmeyer锥形瓶中的150 mL改良Bosshard培养基（121 °C高压灭菌15 min）中，在30 ± 2 °C和130 ± 5 rpm的轨道摇床中孵育。所用改良Bosshard培养基含有（g/L）：KCl（0.025）、MgSO₄·7H₂O（0.025）、KH₂PO₄（0.5）、NaNO₃（1.5）、酵母提取物（1.6）和蔗糖（100）[20,21]。详细方法见文本S2。
【数据】底物孵育温度：30°C；时间：7天；酸性土壤pH：0.97；土壤用量：70 g；土壤孵育时间：1周；ITS序列同一性：99.49–99.66%；GenBank登录号：PZ484815；PDA浓度：3.9% w/v；孢子悬液体积：20 mL Milli-Q水；血细胞计数板面积：0.0025 mm²；深度：0.1 mm；显微镜放大倍数：5×；接种体积：1.5 mL；孢子浓度：2×10⁷孢子/mL；培养基体积：150 mL；锥形瓶体积：250 mL；灭菌条件：121°C，15 min；孵育温度：30 ± 2°C；转速：130 ± 5 rpm；培养基成分（g/L）：KCl 0.025、MgSO₄·7H₂O 0.025、KH₂PO₄ 0.5、NaNO₃ 1.5、酵母提取物 1.6、蔗糖 100
#### 2.2.2 参数优化与污泥生物浸出研究
为优化真菌介导的生物浸出，系统评估了关键操作参数，包括接种量和污泥固体浓度，如表S1所示。接种量在0.5×10⁷至3×10⁷孢子/mL之间变化（表S1.1），污泥固体浓度调整为1%至4%（w/v）（表S1.2）。除优化时变化的参数外，实验在含150 mL工作体积的250 mL Erlenmeyer锥形瓶中进行，接种1%（v/v）孢子悬液（~2×10⁷孢子/mL），在30 °C和130 rpm下孵育。定期取样用于分析有机酸、pH和可溶性重金属。系统性实验设计支持关键参数的评估与优化，也有助于理解不同工艺条件下真菌性能、工艺效率和底物利用情况。这些优化条件进一步应用于其余污泥样品（MSTP和CETP）。每种污泥样品均设置黑曲霉测试组和无接种对照。生物浸出使用1%（v/v）孢子悬液（产生2×10⁷孢子/mL）、1.5%（w/v）污泥固体和蔗糖（10% v/v）。锥形瓶在30 °C、130 rpm下孵育17天。此外，对收集的上清液样品评估pH、产生的有机酸和生物浸出的重金属，以了解浸出效率和酸化动态。此处的浸出效率特指所选金属主动溶解进入水相，在机理上与将金属保留在固体生物量-污泥基质中的被动生物吸附形成对比。最后，生物浸出后，所有污泥类型的处理后污泥（TrS）样品经干燥、研磨成粉末、微波消解，分析残余重金属浓度。详细方法见文本S3。
【数据】接种量范围：0.5×10⁷–3×10⁷孢子/mL；污泥固体浓度范围：1–4% w/v；工作体积：150 mL；锥形瓶体积：250 mL；接种量：1% v/v孢子悬液（~2×10⁷孢子/mL）；温度：30°C；转速：130 rpm；优化后孢子浓度：2×10⁷孢子/mL；优化后污泥固体：1.5% w/v；蔗糖浓度：10% v/v；孵育时间：17天
2.3 分析方法
#### 2.3.1 理化特性
采用重量法分析水分含量（MC%）：样品在103–105 °C烘箱中干燥至恒重，基于重量损失测定[22]。使用CHNS分析仪（Elementar，德国）测定污泥样品的元素组成。采用标准方法测定总固体（TS%）、挥发性固体（VS%）和固定固体（FS%）[23]。上清液经离心（8000 rpm，10 min）并通过0.45 μm尼龙膜过滤器过滤。pH用校准的pH探头测量。
【数据】干燥温度：103–105°C；离心转速：8000 rpm；离心时间：10 min；过滤膜孔径：0.45 μm；仪器：CHNS分析仪（Elementar，德国）
#### 2.3.2 有机酸分析
生物浸出后上清液中有机酸（OAs）的总浓度使用高效液相色谱（HPLC）（Shimadzu，日本）分析。分析在Shim-pack C18柱（4.6 × 250 mm，5 μm粒径；Thermo Scientific）上进行，流速0.5 mL/min，以5 mM H₂SO₄为流动相。使用UV–VIS二极管阵列检测器（DAD）（Shimadzu，日本）在210 nm波长下检测，温度维持30 °C，压力范围0–87 bar。总运行时间15 min，分析物峰在5–10 min之间洗脱[16]。使用CA、GA和OxA储备溶液制备浓度为1、2.5、5、7.5和10 mg/L的标准校准曲线。监测并记录相应峰面积，进一步对浓度（mg/L）作图，从而获得线性校准曲线。
【数据】色谱柱：Shim-pack C18（4.6 × 250 mm，5 μm）；流速：0.5 mL/min；流动相：5 mM H₂SO₄；检测波长：210 nm；柱温：30°C；压力范围：0–87 bar；运行时间：15 min；洗脱时间：5–10 min；标准浓度：1、2.5、5、7.5、10 mg/L
研究结果
3.1 耐重金属真菌的分离
分离的黑曲霉在不同碳底物、培养皿和Bosshard培养基中的生长行为如图S2所示。在测试的底物中，仅花生和洋葱支持大量真菌发育，其他底物显示极少或无生长。这种选择性生长可能是由于花生和洋葱中更高的营养密度和易代谢碳水化合物，而白面包和棕面包含有防腐剂和较低水分含量，抑制了黑曲霉的增殖[30]。为确认耐重金属黑曲霉的存在，将酸性土壤中花生上生长的真菌材料进行四区划线，产生黑色粉末状生物量，表现出黑曲霉典型的宏观形态。初步相差显微镜观察子实体和菌丝进一步支持了这一结果[31]，并通过ITS rDNA测序最终确认（NCBI GenBank登录号：PZ484815）。在琼脂糖上解析时观察到约700 bp的单一离散PCR扩增条带。基于核苷酸同源性和系统发育树分析，序列与黑曲霉显示高度相似性（99.49–99.66%）（图1a–b）。对照运行近两周内未出现生长。随后接种至Bosshard培养基中产生紧密聚集的球形子实体结构（菌丝球），验证了黑曲霉的成功分离和纯度。这些菌丝球随后作为活性真菌生物量用于进一步的参数优化和重金属生物浸出实验。
【数据】支持生长的底物：花生、洋葱；PCR扩增条带大小：~700 bp；序列相似性：99.49–99.66%；GenBank登录号：PZ484815；对照无生长时间：近2周；菌丝球形态：紧密聚集、球形
3.2 真菌孢子接种剂量的优化
#### 3.2.1 pH、生物量浓度和有机酸产量的变化
不同真菌孢子接种剂量下pH、生物量浓度和有机酸产量的变化如图2所示。接种前，测试组和对照组pH均稳定在~5.15 ± 0.05（图2a）。接种后，含0.5×10⁷至3×10⁷孢子/mL的实验组pH略微升高至5.24–5.29，而对照组维持在~5.23；这种短暂升高反映了污泥基质固有的缓冲能力[18]。随着有机酸的产生，所有测试组pH逐渐下降。最低值3.07和3.16分别出现在第11天、接种量为1.5×10⁷和2.5×10⁷孢子/mL时，而最低pH 2.98出现在2×10⁷孢子/mL时。该接种水平也产生了最高效的酸化曲线，被确定为最佳剂量。类似地，在黑曲霉介导的废流化催化裂化催化剂重金属生物浸出中，孵育结束时观察到pH为2.7至3.1[21,32]。此外，单因素方差分析显示不同处理条件下pH降低存在高度显著差异（F(6,14) = 794.80，p < 0.0001）。Tukey事后检验的两两比较确认，2×10⁷孢子/mL在降低pH方面显著优于更高的3×10⁷和更低的0.5×10⁷孢子/mL处理（p < 0.05）（图S3a）。生物量积累呈现相似趋势，第11天在1.5×10⁷和2.5×10⁷孢子/mL时最大产量分别为21.38 g/L和20.45 g/L（图2b）。最高生物量（22.14 g/L）在2×10⁷孢子/mL时实现。相反，超过此最优值的接种量导致更高的最终pH值（3.31–3.45）和更低的生物量水平（17.74–19.29 g/L）。未接种的非生物对照组维持pH ~5.24，由于天然污泥基质对酶学测定的干扰，记录了可忽略的分析背景当量0.29 g/L生物量。单因素方差分析表明不同接种浓度间生物量产量存在高度显著差异（F(6, 14) = 289.37，p < 0.0001）。Tukey事后检验的两两比较显示，2×10⁷孢子/mL实现的生物量显著高于3×10⁷（p = 0.0076）和0.5×10⁷孢子/mL（p < 0.0001）处理（图S3b）。类似地，先前一项使用黑曲霉从赤泥（铝土矿残渣）中去除重金属的研究报道了第10天最大生物量28.6 g/L及糖代谢[33]。第12天起生物量的轻微下降最可能是由于培养基中次级代谢产物积累引起的毒性[34]。就有机酸产量而言，接种2×10⁷孢子/mL的培养物在第11天产生最高浓度：CA 77.97 mM、OxA 15.82 mM和GA 13.46 mM（图2c–e）。单因素方差分析显示不同接种水平间CA（F(6,14) = 1650.04，p < 0.0001）、GA（F(6,14) = 1362.74，p < 0.0001）和OxA（F(6,14) = 659.16，p < 0.0001）存在高度显著差异。Tukey事后检验确认，对于GA和OxA，2×10⁷时的最大产量在统计学上优于所有其他操作设置（p < 0.05）（图S3c–e）。对于CA，2×10⁷孢子/mL优于对照组和大多数处理组（p < 0.05），但与相邻的2.5×10⁷孢子/mL共享统计学上可比的高原期（p > 0.05），标志着结构系统酸化的明显优化阈值。此外，更高和更低的孢子浓度均产生显著更低的有机酸滴度。在<2×10⁷孢子/mL时，缓慢的生物量建立和延迟的形态发育限制了向高产酸代谢的转变，减少了CA、OxA和GA的合成[35]。相反，在>2×10⁷孢子/mL时，过高的孢子密度导致营养快速耗尽、代谢应激、抑制性代谢产物积累、O₂限制以及形成生理活性差的大型紧密菌丝球，所有这些都抑制了生物量生长和有机酸产生[36]。在一项类似研究中，Qu等[33]报道了黑曲霉孵育10天内产生82.3 mM（CA）、18.3 mM（OxA）和15.1 mM（GA）。因此，2×10⁷孢子/mL被确认为后续生物浸出研究的最佳真菌孢子接种剂量。
【数据】初始pH：~5.15 ± 0.05；接种后pH升高至：5.24–5.29；对照组pH：~5.23；最低pH：2.98（2×10⁷孢子/mL）；pH 3.07（1.5×10⁷）、3.16（2.5×10⁷）；pH ANOVA：F(6,14) = 794.80，p < 0.0001；最高生物量：22.14 g/L（2×10⁷孢子/mL）；生物量21.38 g/L（1.5×10⁷）、20.45 g/L（2.5×10⁷）；过高接种量pH：3.31–3.45；过低生物量：17.74–19.29 g/L；对照组生物量：0.29 g/L；生物量ANOVA：F(6,14) = 289.37，p < 0.0001；CA最高产量：77.97 mM；OxA最高产量：15.82 mM；GA最高产量：13.46 mM；CA ANOVA：F(6,14) = 1650.04，p < 0.0001；GA ANOVA：F(6,14) = 1362.74，p < 0.0001；OxA ANOVA：F(6,14) = 659.16，p < 0.0001；文献对比：CA 82.3 mM、OxA 18.3 mM、GA 15.1 mM（10天）
#### 3.2.2 重金属去除
在优化黑曲霉孢子接种剂量期间，评估了DSTP污泥中三种重金属（Cu、Fe和Zn）的生物浸出行为（图3）。金属溶解表现出对接种浓度和生物浸出时间的明显依赖性。最高去除效率出现在第11天、接种密度为2×10⁷孢子/mL时，测试组中Zn显示出最高溶解率（78.5%），其次是Fe（74.3%）和Cu（72.9%）。而对照组三种重金属最高仅为2.8–5.6%。单因素方差分析确认不同接种水平间Cu（F(6,14) = 492.77，p < 0.0001）、Fe（F(6,14) = 879.83，p < 0.0001）和Zn（F(6,14) = 746.58，p < 0.0001）存在高度显著差异（图S4a–c）。此外，Tukey事后分析显示，对于Fe和Zn，2×10⁷孢子/mL唯一优越，显著超过所有其他处理组（p < 0.05）。对于Cu，2×10⁷设置显著优于3×10⁷、1.5×10⁷和0.5×10⁷水平（p < 0.05），但与2.5×10⁷和1×10⁷孢子/mL共享统计等效的性能高原期（p > 0.05）。Zn相对更高的浸出率归因于其更大的酸溶性（F1）和与稳定矿物组分较弱的结合。
【数据】最高去除率（第11天，2×10⁷孢子/mL）：Zn 78.5%、Fe 74.3%、Cu 72.9%；对照组去除率：2.8–5.6%；Cu ANOVA：F(6,14) = 492.77，p < 0.0001；Fe ANOVA：F(6,14) = 879.83，p < 0.0001；Zn ANOVA：F(6,14) = 746.58，p < 0.0001
讨论与解读
本研究证明黑曲霉介导的生物浸出是一种有效的双用途方法，可同时实现污水污泥和危险制革CETP污泥的解毒，为重金属去除与资源回收耦合提供了可持续途径。该过程通过持续生物酸化和破坏金属-配体相互作用，解决了传统酸浸的局限性，特别是强金属-有机络合问题。在优化操作条件下，DSTP和MSTP污泥中Cu、Fe和Zn的去除效率超过65%，而CETP污泥中去除率>60%（Cu除外，约50%）。BCR-SEP分级确认处理后污泥中的残余金属主要稳定在高度难溶组分中，确保了环境安全性，同时从机理上阐明了CETP中观察到的提取限制。选择性硫化物沉淀实现了重金属的高效回收，产生高纯度金属硫化物（~35–69%），展示了将pH调控的硫化物溶解度与选择性金属回收及纯度提升耦合的新颖性。总体而言，将优化工艺条件下黑曲霉介导的重金属去除与后续金属回收相结合，建立了面向循环经济的污泥增值框架。
编译者解读：该研究的方法学价值在于将真菌代谢产酸与硫化物选择性沉淀串联，构建了"浸出-回收"闭环，而非止步于去除率报告。选用黑曲霉而非化能自养细菌，规避了污泥高有机质对细菌活性的抑制，同时利用其分泌柠檬酸、草酸和葡萄糖酸的多酸体系实现广谱金属溶解。然而，CETP污泥中Cu浸出率仅约50%，暗示制革污泥中Cr-有机络合物的稳定性可能限制了质子攻击效率。此外，硫化钠沉淀虽实现金属回收，但硫化物投加量与纯度之间的定量关系未在节选中详述，工程放大时需补充试剂成本与二次污染评估。
参考来源
期刊：Journal of Water Process Engineering, 2026
DOI: 10.1016/j.jwpe.2026.110530
DOI: 10.1016/j.jwpe.2026.110530