来源：Carvacrol nanoemulsion achieves potent suppression of Aspergillus niger on high-moisture fruits by disrupting carbon-nitrogen metabolic homeostasis and triggering oxidative stress（Postharvest Biology and Technology）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
黑曲霉是高湿水果采后腐烂的主要致病真菌，造成严重食品浪费与经济损失。香芹酚作为植物源酚类化合物具有显著抗真菌潜力，但水溶性差、易挥发限制了其应用。本研究以OSA改性淀粉纳米颗粒稳定香芹酚纳米乳（CN），系统比较了CN与乙醇溶解香芹酚（CE）的抗真菌效果，并通过转录组与蛋白质组整合分析揭示了CN抑制黑曲霉的分子机制。CN粒径更小、穿透力更强，MIC低至156.25 mg/L，仅为CE的一半，并在猕猴桃与草莓活体实验中显著抑制病斑扩展。
研究背景
采后真菌感染是新鲜农产品腐烂的首要原因，全球经济损失巨大。高湿类商品——尤其是营养丰富、表皮薄弱的软质水果——采后生理代谢旺盛，极易被真菌侵染。黑曲霉是曲霉属中常见的种类，擅长在受损组织中定殖，并在贮藏条件下快速增殖。猕猴桃和草莓等高价值水果需要高湿贮藏以维持品质，但采收和包装过程中不可避免产生微小机械损伤，恰好为黑曲霉感染创造了理想入口。已有研究报道，黑曲霉常从草莓和猕猴桃表面微生物群落中分离获得，加速果实腐烂并缩短货架期。除造成可见的菌丝过度生长、组织软化和变色外，部分产毒菌株还能产生赭曲霉毒素A，对食品安全和消费者健康构成严重威胁。传统化学杀菌剂因残留、抗性和环境问题日益受到限制，开发天然、高效的替代防控策略成为迫切需求。
研究方法
2.1 材料
香芹酚购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司。黑曲霉（FSCC114002）、马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）和马铃薯葡萄糖肉汤（PDB）培养基购自广州环凯微生物科技有限公司。马铃薯淀粉由北京奥博星生物技术有限公司提供；OSA和大豆油购自上海麦克林生化科技有限公司。ROS检测试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司。MDA含量检测试剂盒和ATP含量检测试剂盒购自苏州科铭生物技术有限公司。麦角甾醇标准品购自上海源叶生物科技有限公司。甲醇购自上海星可高纯溶剂有限公司。乙醇购自上海凌峰化学试剂有限公司。碘化丙啶（PI）和磷酸盐缓冲液（PBS）购自北京雷根生物技术有限公司。
【数据】香芹酚来源：上海阿拉丁；菌株：黑曲霉FSCC114002；培养基：PDA、PDB；其他试剂来源：原文已详述
2.2 CN的制备
CN按照此前报道的方法制备（Xie et al., 2024）。简言之，首先使用超声辅助Fenton体系合成淀粉纳米颗粒。随后，用OSA对淀粉纳米颗粒进行改性以获得OSA改性淀粉纳米颗粒。最后，使用这些OSA改性淀粉纳米颗粒稳定含3%香芹酚（溶于大豆油）的纳米乳液，通过高速均质和超声处理制备，标记为NEs。CN的理化性质，包括粒径、电位、形貌和稳定性，以及其对柑橘类水果的有效保鲜效果，已在我们此前的工作中进行了全面表征和验证（Xie et al., 2025）。
【数据】香芹酚浓度：3%（溶于大豆油）；制备方法：超声辅助Fenton体系合成淀粉纳米颗粒，OSA改性，高速均质+超声处理；CN理化表征：粒径、电位、形貌、稳定性（详见Xie et al., 2025）
2.3 菌丝生长抑制评估
将黑曲霉接种于PDA平板中央，在28 °C、90%相对湿度（RH）条件下培养7 d。随后将活化的菌丝（直径7 mm）转移至含不同处理的PDA平板中央：对照组（CK，0%香芹酚）、CN组（含0.5%、1%、2%、3%和4% NEs，v/v）和CE组（用乙醇溶解的等浓度香芹酚）。在28 °C、90% RH条件下培养7 d后，测量菌丝生长直径，并计算各处理组的抑制率。此外，将活化菌丝用蒸馏水洗涤并过滤获得孢子悬液（1 ×10⁶ 孢子/mL）。取100 μL孢子悬液加入100 mL含特定体积NEs的PDB培养基中。培养物在28 °C下振荡培养，实验结束时测量菌丝干重。CK：对照；0.08CE或0.16CE：含80 mg/L或160 mg/L CE（含1%乙醇）的PDB培养基；0.08CN或0.16CN：向PDB培养基中加入NEs使香芹酚浓度达到80或160 mg/mL。
【数据】培养温度：28 °C；相对湿度：90% RH；培养时间：7 d；菌丝直径：7 mm；孢子悬液浓度：1 ×10⁶ 孢子/mL；CN浓度梯度：0.5%、1%、2%、3%、4%（v/v）；CE/CN处理浓度：80、160 mg/L；接种量：100 μL孢子悬液/100 mL PDB
2.4 最低抑菌浓度（MIC）和最低杀菌浓度（MFC）测定
采用96孔板稀释法测定CN的MIC。在PDB培养基中制备CN系列稀释液以形成浓度梯度。向每孔中加入孢子悬液（100 μL，1 ×10⁶ 孢子/mL）。在28 °C、90% RH条件下培养3 d后，将MIC定义为完全阻止可见菌丝生长的最低浓度。对于MFC测定，从无肉眼可见菌丝生长的孔中取100 μL涂布于PDA上，在相同条件下培养3 d。MFC定义为导致真菌完全无生长的最低浓度，表明其为杀菌而非抑菌活性。
【数据】接种量：100 μL孢子悬液（1 ×10⁶ 孢子/mL）/孔；培养温度：28 °C；相对湿度：90% RH；培养时间：3 d；MIC定义：完全阻止可见菌丝生长的最低浓度；MFC定义：完全无真菌生长的最低浓度
2.5 SEM和TEM超微结构分析
使用SEM和TEM观察菌丝的形态变化。对于SEM分析，将菌丝（7 mm）置于含CN的PDA平板中央。平板在28 °C、90% RH条件下培养7 d。随后从菌落边缘采集菌丝圆片（7 mm），在2.5%戊二醛中固定12 h，然后用梯度乙醇系列（50%、70%、95%和100%）脱水，每步15 min。样品随后干燥、喷金，使用SEM（SU-8020，Hitachi，日本）观察。对于TEM观察，将孢子悬液（100 μL，1 ×10⁶ 孢子/mL）接种到25 mL PDB中，在28 °C培养2 d。所得菌丝暴露于CN处理12 h。经过离心、洗涤、固定和脱水程序后，制备菌丝超薄切片，使用TEM（JEM-1200EX，Hitachi，日本）观察。
【数据】菌丝圆片直径：7 mm；固定液：2.5%戊二醛；固定时间：12 h；乙醇梯度：50%、70%、95%、100%；每步脱水时间：15 min；SEM培养条件：28 °C、90% RH、7 d；TEM培养条件：28 °C、2 d；CN处理时间：12 h；孢子悬液：100 μL（1 ×10⁶ 孢子/mL）/25 mL PDB；仪器：SEM SU-8020（Hitachi）、TEM JEM-1200EX（Hitachi）
2.6 碘化丙啶（PI）染色和活性氧（ROS）检测
将孢子悬液（100 μL，1 ×10⁶ 孢子/mL）在25 mL PDB中于28 °C培养3 d。然后将发育的菌丝暴露于CN处理4 h。将菌丝样品（0.1 g）转移至1.0 mL PBS（0.2 M，pH 7.0）中，加入20 μL PI染色液或1 μL 10 μM DCFH-DA，在28 °C黑暗条件下孵育30 min。染色后，用PBS（0.2 M，pH 7.0）洗涤菌丝三次以去除多余染色试剂。随后使用荧光显微镜（Primostar 3，Zeiss，德国）分别在550 nm和488 nm激发波长下观察PI染色和ROS积累。
【数据】孢子悬液：100 μL（1 ×10⁶ 孢子/mL）/25 mL PDB；培养温度：28 °C；培养时间：3 d；CN处理时间：4 h；菌丝样品量：0.1 g；PBS浓度：0.2 M，pH 7.0；PI用量：20 μL；DCFH-DA用量：1 μL（10 μM）；孵育条件：28 °C、黑暗、30 min；洗涤次数：3次；激发波长：PI 550 nm、ROS 488 nm；仪器：荧光显微镜Primostar 3（Zeiss）
2.7 细胞质膜完整性评估
参照Ma et al.（2018）的方法测定真菌细胞电解质泄漏。将黑曲霉孢子悬液接种到PDB中，在28 °C振荡培养48 h。用无菌水洗涤后，将菌丝生物量（1.5 g）悬浮于25 mL CN中，每小时监测细胞外电导率。此外，将CN加入含1 × 10⁶ 孢子/mL的25 mL PDB中，在28 °C孵育4 h。在0 h和4 h时间点测量上清液在260 nm和280 nm处的吸光度。OD260表示核酸泄漏，OD280反映受损细胞的蛋白质泄漏。
【数据】培养温度：28 °C；培养时间：48 h；菌丝生物量：1.5 g；悬浮体积：25 mL CN；电导率监测频率：每小时；孢子浓度：1 × 10⁶ 孢子/mL；孵育温度：28 °C；孵育时间：4 h；检测波长：260 nm（核酸）、280 nm（蛋白质）；检测时间点：0 h、4 h
2.8 MDA、ATP和麦角甾醇含量评估
将黑曲霉菌丝接种于无菌PDA培养基中央，在28 °C、90% RH的恒温恒湿培养箱中培养7 d。向培养基中加入无菌蒸馏水洗脱菌丝，经两层无菌纱布过滤获得孢子悬液。取100 μL孢子悬液（1 ×10⁶ 孢子/mL）接种到100 mL无菌PDB培养基中，在28 °C、150 rpm振荡培养箱中培养3 d，然后用CN处理6 h。处理后，离心洗涤菌丝，立即收集，在液氮中冷冻，匀浆备用。使用相应检测试剂盒测定MDA和ATP含量。麦角甾醇含量测定参照Li et al.（2022）的方法并稍作修改，使用配备UV检测器的高效液相色谱（HPLC）系统（型号L3000，Rigol Technologies Co., Ltd.，苏州，中国）。准确称取0.2 g匀浆菌丝样品，加入1 mL无水乙醇。使用自动匀浆器在4 °C、60 Hz条件下匀浆60 s，然后在冰水浴中超声提取30 min，并在4 °C冰箱中浸泡过夜。提取液在8000 g、4 °C条件下离心10 min，小心吸取上清液，通过0.22 μm有机相滤膜过滤，收集滤液用于HPLC分析。HPLC分析使用Compass-C18反相色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流速0.7 mL/min，柱温维持30 °C，检测波长设定为320 nm。
【数据】培养条件：28 °C、90% RH、7 d（PDA）；孢子悬液：100 μL（1 ×10⁶ 孢子/mL）/100 mL PDB；振荡培养：28 °C、150 rpm、3 d；CN处理时间：6 h；菌丝样品量：0.2 g；无水乙醇用量：1 mL；匀浆条件：4 °C、60 Hz、60 s；超声提取：冰水浴、30 min；浸泡：4 °C过夜；离心：8000 g、4 °C、10 min；滤膜孔径：0.22 μm；色谱柱：Compass-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流速：0.7 mL/min；柱温：30 °C；检测波长：320 nm；HPLC型号：L3000（Rigol Technologies）
研究结果
3.1 CN对菌丝生长的抑制作用
CE和CN对黑曲霉的抑制效果见图1A-E。随着香芹酚浓度的增加，黑曲霉菌丝生长逐渐受到抑制（图1A）。值得注意的是，在等浓度条件下，含CN的PDA平板上的真菌生长始终弱于CE组。定量分析（图1B-C）也表明，纳米包封显著增强了香芹酚的抗真菌活性。在4%浓度下，CN将菌落直径降至8.77 mm，抑制率为85.57%，显著优于CE（分别为17.80 mm和70.70%；p < 0.01）。CN浓度与抑制率之间的回归分析（图1D）显示强正相关（R²=0.9927），IC50值为1.35%。如图1E所示，CE的MIC和MFC分别为312.5和625 mg/L。CN表现出显著更低的MIC（156.25 mg/L）和MFC（312.5 mg/L），表明其在更低浓度下具有更强的杀菌活性。
【数据】4% CN：菌落直径8.77 mm，抑制率85.57%；4% CE：菌落直径17.80 mm，抑制率70.70%；p < 0.01；R²=0.9927；IC50=1.35%；CE MIC=312.5 mg/L，CE MFC=625 mg/L；CN MIC=156.25 mg/L，CN MFC=312.5 mg/L
3.2 CN对菌丝的形态和超微结构损伤
使用SEM和TEM检查了黑曲霉的形态和超微结构变化（图2）。在对照组中，菌丝表面光滑、完整，形态正常（图2A）。相比之下，CE处理造成明显损伤，菌丝出现皱缩和塌陷（图2B）。CN引起更严重的改变，菌丝失去丝状结构，表现为极度变形、异常肿胀和大的球形突起（图2C）。TEM分析证实了这些发现。对照细胞显示组织良好的超微结构，细胞壁（CW）完整，质膜清晰，细胞核（N）和脂滴（LDs）等细胞器清晰可见，嵌入致密的细胞质中（图2D）。CE处理的细胞表现出严重的质壁分离、细胞质紊乱以及肿胀的平滑内质网（SER）和自噬体（Ab）增殖，表明膜功能破坏和细胞应激（图2E）。CN处理造成不可逆的破坏，细胞器解体，细胞质大量泄漏，留下大量空泡和凋亡样小体（图2F）。
【数据】SEM培养：28 °C、90% RH、7 d；TEM培养：28 °C、2 d，CN处理12 h；CK组：菌丝表面光滑完整；CE组：菌丝皱缩塌陷，质壁分离，SER和自噬体增殖；CN组：菌丝极度变形、异常肿胀、球形突起，细胞器解体，细胞质泄漏，大量空泡和凋亡样小体
3.3 ROS含量和膜完整性
通过荧光显微镜评估了细胞内ROS积累和膜完整性（图3）。使用DCFH-DA探针（绿色荧光）可视化细胞内ROS积累（Kong et al., 2023）。CK组荧光微弱，表明健康菌丝中ROS处于基础水平（图3A1-A2）。相比之下，CE和CN处理均引发明显的、剂量依赖性的ROS生成增加（图3B2-B5）。关键的是，CN组的绿色荧光明显更亮、更广泛，凸显了其在更低浓度下诱导氧化应激的优越能力。通过PI染色评估质膜完整性，PI选择性进入膜受损细胞，显示红色荧光。正如预期，对照菌丝对PI不透，无红色荧光（图3D1）。处理后，CE和CN均观察到剂量依赖性的PI摄取增加，证实香芹酚破坏了真菌膜。CN处理的菌丝显示出强烈且广泛的红色荧光（图3D5）。
【数据】ROS探针：DCFH-DA（绿色荧光）；PI染色（红色荧光）；CK组：ROS荧光微弱，PI无荧光；CE和CN组：剂量依赖性ROS增加和PI摄取增加；CN组荧光强度和范围均大于CE组
3.4 细胞膜通透性和细胞泄漏
电导率是广泛使用的细胞膜完整性指标。如图3E所示，CK组电导率随时间保持相对稳定，表明未处理条件下膜完整性良好。相比之下，处理组表现出显著的膜透化和离子泄漏，具有剂量依赖性效应。值得注意的是，CN组电导率增加约为CE组的1.1–1.2倍。为评估CE和CN对黑曲霉膜通透性的影响，在处理后0 h和4 h测量了核酸（图3G）和蛋白质泄漏（图3H）。4 h后，观察到浓度依赖性的核酸泄漏增加，CN处理组在等浓度下核酸释放量高于CE。同样，蛋白质泄漏以剂量依赖性方式显著增加，CN处理诱导的蛋白质外排高于CE处理。在0.16 mg/L时，CN组蛋白质泄漏达到约0.29吸光度单位，几乎是CE组的3倍。
【数据】CK组电导率：随时间稳定；CN组电导率：约为CE组的1.1–1.2倍；检测时间点：0 h、4 h；0.16 mg/L CN蛋白质泄漏：约0.29吸光度单位，约为CE组的3倍
3.5 麦角甾醇、MDA和ATP含量
为进一步阐明CN对黑曲霉生理代谢的影响，测定了各组菌丝中麦角甾醇、MDA和ATP含量。麦角甾醇是真菌细胞膜的关键组分，与膜完整性和流动性直接相关。CK组麦角甾醇含量为125.12 μg/g FW（图3I）。CE和CN处理后呈浓度依赖性下降，CN组抑制作用更为突出。0.16CN组麦角甾醇含量仅为70.26 μg/g FW，较对照组下降43.85%，显著低于0.16CE组（83.58 μg/g FW）。这些结果表明CN能更有效抑制黑曲霉麦角甾醇合成，破坏细胞膜结构完整性。作为脂质过氧化的特征产物，MDA含量可直接反映细胞氧化损伤程度。CE和CN处理后MDA含量增加，CN组脂质过氧化水平更为显著（图3J），表明CN能诱导黑曲霉产生更多ROS，引发严重脂质过氧化，破坏细胞膜结构稳定性。ATP含量直接反映线粒体功能和能量供应状态。如图3K所示，CK组ATP含量最高，达到3.59 nmol/g。随着CE和CN处理浓度从0.08增加至0.16 nmol/g，菌丝ATP含量呈显著下降趋势。值得注意的是，相同浓度下CN处理组的效果显著强于CE处理组。
【数据】CK组麦角甾醇：125.12 μg/g FW；0.16CN组麦角甾醇：70.26 μg/g FW，较对照下降43.85%；0.16CE组麦角甾醇：83.58 μg/g FW；CK组ATP：3.59 nmol/g；CE和CN处理浓度：0.08→0.16 nmol/g，ATP显著下降；MDA：CE和CN处理后增加，CN组更显著
3.6 CN对黑曲霉的活体抗真菌活性
如图4所示，活体实验结果表明CN对猕猴桃和草莓中的黑曲霉均提供了强效的、剂量依赖性保护。在所有处理中，与CK对照相比，递增剂量的CN逐步限制了感染病斑的发展，1.6CN在两种水果中均产生最强保护，优于CE（图4A、C）。在猕猴桃中，第6天时1.6CN组病斑直径（25.97 mm）显著小于CK（38.38 mm）和CE（34.21 mm）（p < 0.05）（图4B）。在草莓中，1.6CN处理在第4天产生最大病斑缩减，CE较CK有所改善（图4D）。
【数据】猕猴桃第6天病斑直径：1.6CN=25.97 mm，CK=38.38 mm，CE=34.21 mm，p < 0.05；草莓：1.6CN第4天病斑缩减最大；n=3
3.7 转录组学分析
为全面了解纳米乳抗真菌作用的分子机制，对CN处理和CK的黑曲霉菌丝进行了转录组分析（图5）。共测序6个转录组文库，产生38.7 Gb clean bases，每个样本超过5.93 Gb。Q20和Q30碱基百分比分别大于99.09%和96.46%，表明测序数据质量高，适合下游分析。主成分分析（PCA）显示CK和CN组之间明显且显著的分离（图5A）。第一主成分（PC1）占总方差的85.08%，表明CN处理导致黑曲霉基因表达谱发生深刻变化。
【数据】转录组文库：6个；clean bases总量：38.7 Gb；每样本：>5.93 Gb；Q20：>99.09%；Q30：>96.46%；PC1方差贡献率：85.08%
3.8 蛋白质组学分析
对CN处理和CK的黑曲霉进行了蛋白质组学分析（图7）。PCA图显示CK和CN组之间蛋白质表达谱存在明显分离（图7A）。蛋白质功能注释（图7B）对差异表达蛋白（DEPs）进行了功能分类。火山图（图7C）展示了DEPs的分布情况。差异聚类热图（图7D）显示了DEPs的表达模式。KEGG分类（Top 20）（图7E）和GO富集（Top 30）（图7F）图展示了DEPs涉及的代谢通路和生物学功能。
【数据】PCA：CK与CN组蛋白质表达谱明显分离；分析内容：蛋白质功能注释、火山图、聚类热图、KEGG分类（Top 20）、GO富集（Top 30）
3.9 转录组与蛋白质组整合分析
对CN处理和CK的黑曲霉进行了转录组和蛋白质组的整合分析（图8）。Venn图（图8A）显示了基因和蛋白质的重叠情况。上调/下调基因和蛋白质数量见图8B。O2PLS分析（图8C）揭示了转录组和蛋白质组之间的整体相关性。GO术语（图8D）和KEGG通路（图8E）的相关性分析展示了mRNA和蛋白质水平之间的一致性。基于整合分析结果，提出了香芹酚抑制黑曲霉的机制模型（图8F）。
【数据】分析内容：Venn图、上/下调基因和蛋白质、O2PLS分析、GO术语相关性、KEGG通路相关性、机制模型
讨论与解读
黑曲霉是果蔬采后腐烂的致病菌，导致贮藏和流通中的品质劣变和经济损失。香芹酚作为酚类单萜，因其天然抗真菌活性在食品保鲜和绿色病害防控中受到广泛关注。多项研究表明，香芹酚在体外对多种植物病原真菌具有广谱抗真菌活性，包括炭疽菌属、青霉属和链格孢属，其抑制作用常与膜破坏、细胞内泄漏和氧化应激反应相关。然而，游离香芹酚的实际效力受其强疏水性、在水体系中分散性有限和挥发性制约，降低了其生物利用度。大量研究表明，纳米乳体系有望克服这些局限，有效增强抗真菌活性并延长作用时间。本研究评估了香芹酚纳米乳与游离香芹酚的抗真菌潜力，重点探究纳米乳体系为何表现出优越的抗菌活性，以及香芹酚抑制黑曲霉的分子机制。体外抗真菌实验表明，CN表现出优越的抗真菌功效，纳米级液滴增强了细胞膜穿透，导致更低的MIC（156.25 mg/L）和MFC（312.5 mg/L），仅为CE的一半。CN诱导了更严重的菌丝膜和超微结构损伤、ROS积累、电解质泄漏、麦角甾醇和ATP含量降低以及MDA水平升高。活体实验证明CN减少了猕猴桃和草莓贮藏期间的病斑直径。转录组和蛋白质组整合分析揭示，CN深刻扰乱了黑曲霉的代谢稳态：黑曲霉上调ABC转运蛋白以外排香芹酚，但线粒体氧化磷酸化下调导致ATP缺乏；同时CN抑制了丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢以及丙酸代谢中的关键基因/蛋白质，阻断了氮同化、核苷酸合成和毒性中间体解毒。CN诱导的氧化损伤、生物合成停滞以及DNA复制和修复功能受损导致膜损伤和大分子泄漏，最终引起不可逆的细胞死亡。
编译者解读：该研究以OSA改性淀粉纳米颗粒稳定香芹酚构建纳米乳，巧妙利用纳米尺度增强膜穿透性，将MIC降低一半，体现了纳米递送系统在天然抗菌剂增效中的核心价值。方法上，转录组与蛋白质组整合分析为解析多靶点作用机制提供了系统框架，克服了单一组学的局限。然而，研究未涉及CN在果实表面的残留动态与感官品质影响，且活体实验周期较短，长期贮藏稳定性有待验证。从合成生物学视角看，未来可考虑将香芹酚生物合成途径导入工程菌株实现绿色生产，并与纳米递送体系结合，构建从生产到应用的完整链条。
参考来源
期刊：Postharvest Biology and Technology, 2026
DOI: 10.1016/j.postharvbio.2026.114347
DOI: 10.1016/j.postharvbio.2026.114347