来源：Sustainable arsenic bioremediation by a marine macroalgal endophyte, Bacillus subtilis ULB16（Journal of Hazardous Materials Advances）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
砷污染威胁环境可持续性与粮食安全，其中As(III)毒性最强、迁移性最高。本研究从海洋大型藻石莼中分离获得一株内生枯草芽孢杆菌ULB16，系统评估了其对As(III)的耐受、解毒能力及遗传基础。该菌株对As(III)的最低抑制浓度达12 mg/mL，可在pH 4–11、28–45 °C范围内维持生长，48 h内从培养液中去除约80%的砷，且胞内积累极低。全基因组测序鉴定出arsR、arsB、arsC、czrA、cotA等多个砷抗性相关基因。水培实验中，菌株处理显著缓解了As(III)对绿豆的毒害。
研究背景
砷是一种广泛分布于陆生和水生环境中的有毒类金属，被公认为全球最危险的环境污染物之一。其无机形态As(III)因溶解度高、生物利用度强且对细胞巯基具有强亲和力，成为毒性最强、迁移性最高的砷形态。砷污染来源兼具自然地质过程与人为活动——采矿、冶炼、工业排放、过度开采地下水、农药施用、化石燃料燃烧以及含砷农用化学品的应用均会释放砷。地下水介导的迁移已导致全球许多地区饮用水和农业土壤的广泛砷污染，对生态系统健康、农业生产力和粮食安全构成严重威胁。无机砷在粮食作物（尤其是用含砷灌溉水种植的水稻）中的积累，因其沿食物链高效传递，已成为全球性食品安全问题。慢性砷暴露与致癌、致突变、神经、心血管及发育障碍相关，国际癌症研究机构（IARC）已将无机砷列为1类人类致癌物。
传统的砷修复方法存在成本高、二次污染等问题。利用天然具有抗性的微生物进行生物解毒，为常规修复方法提供了可持续的替代方案。海洋大型藻内生菌长期暴露于复杂海洋环境，可能进化出独特的金属耐受机制，是挖掘新型砷抗性菌株的潜在资源。
研究方法
2.1 细菌与培养条件
本研究所用内生细菌枯草芽孢杆菌ULB16此前分离自海洋大型藻石莼（Ulva lactuca），培养物保藏于Amrita Vishwa Vidyapeetham的Amrita生物技术学院。该菌株常规维持于用人工海水（ASW）配制的营养琼脂（NA）平板上，37 °C培养。实验用培养物在ASW配制的营养肉汤（NB）中、37 °C、120 rpm振荡条件下培养（Anand et al., 2025）。
【数据】菌株：枯草芽孢杆菌ULB16；培养基：营养琼脂/营养肉汤（人工海水配制）；温度：37°C；转速：120 rpm；保存机构：Amrita生物技术学院
2.2 枯草芽孢杆菌ULB16重金属抗性筛选
通过评估枯草芽孢杆菌ULB16在多种金属盐存在下的生长情况来测定其重金属抗性。细菌在营养肉汤（NB）中、37 °C、120 rpm振荡培养过夜。随后将1%的过夜培养物加入含50 mL最小盐培养基（MSM）的100 mL锥形瓶中。MSM组成（g/L）：Na₂HPO₄ 4.5 g、KH₂PO₄ 1.5 g、NH₄Cl 0.3 g、MgSO₄ 0.1 g、酵母提取物0.5 g、C₆H₁₂O₆ 5.0 g，分别单独补充100 µg/mL的每种重金属化合物（砷酸钠、亚砷酸钠、硫酸铜、氯化汞、醋酸铅、氯化镉和重铬酸钾）。接种后的锥形瓶在37 °C、120 rpm连续振荡下培养48 h。通过光密度（λ−600 nm，Biophotometer D30，Eppendorf，美国）测量每种金属离子存在下的生长情况，以确定菌株的抗性谱（Roy et al., 2024）。
【数据】培养基：MSM（Na₂HPO₄ 4.5 g/L、KH₂PO₄ 1.5 g/L、NH₄Cl 0.3 g/L、MgSO₄ 0.1 g/L、酵母提取物0.5 g/L、葡萄糖5.0 g/L）；金属浓度：100 µg/mL；温度：37°C；时间：48 h；转速：120 rpm；接种量：1%；检测波长：600 nm；仪器：Biophotometer D30
2.3 As(III)对细菌生长和形态影响的分析
通过菌落形态观察、生长动力学以及扫描电子显微镜（SEM）和傅里叶变换红外（FT-IR）光谱的细胞表征，分析As(III)对枯草芽孢杆菌ULB16生长和形态的影响。
#### 2.3.1 菌落形态分析
将枯草芽孢杆菌ULB16的单菌落点种在含100 µg/mL亚砷酸钠的无菌MSM琼脂平板中心。对照平板通过将细菌单菌落接种在不含亚砷酸钠的MSM琼脂上制备。接种后的平板在37 °C培养48 h。记录菌落形态的表型变异，包括大小、质地和色素沉着（Sher et al., 2021）。
【数据】菌株：枯草芽孢杆菌ULB16；培养基：MSM琼脂；亚砷酸钠浓度：100 µg/mL；温度：37°C；时间：48 h；观察指标：菌落大小、质地、色素沉着
#### 2.3.2 扫描电子显微镜（SEM）
将在补充有100 µg/mL As(III)和不含As(III)（对照）的MSM肉汤中生长（37 °C，48 h）的细菌细胞，在4 °C、6000 rpm离心10 min收获。细胞沉淀用0.1 M磷酸盐缓冲盐水（pH 7.4）洗涤两次，铺在无菌盖玻片上制成薄涂片，风干。然后加入2.5%戊二醛固定细菌涂片，随后通过梯度乙醇系列（30–100%）逐步脱水。脱水样品风干后喷金。镀金样品在扫描电子显微镜（JEOL JSM-7610F，日本）下检查，观察As(III)暴露引起的细胞形态和表面结构改变（Ghosh et al., 2018）。
【数据】As(III)浓度：100 µg/mL；培养温度：37°C；培养时间：48 h；离心：6000 rpm、10 min、4°C；固定剂：2.5%戊二醛；脱水：梯度乙醇30–100%；缓冲液：0.1 M PBS（pH 7.4）；仪器：JEOL JSM-7610F SEM
#### 2.3.3 傅里叶变换红外（FT-IR）光谱
进行FTIR分析以鉴定暴露于As(III)前后细菌细胞表面官能团及相关大分子的变化。枯草芽孢杆菌ULB16在补充和不含（对照）As(III)的MSM肉汤中、37 °C、120 rpm振荡培养48 h。细胞在4 °C、6000 rpm离心15 min收获，用0.1 M磷酸盐缓冲盐水（PBS，pH 7.4）洗涤三次。洗涤后的细胞沉淀冻干获得细粉。对照和As(III)处理样品的冻干生物量使用傅里叶变换红外光谱仪（PerkinElmer，Waltham，MA，美国）分析。采用溴化钾（KBr）压片法，将1 mg细菌粉末与0.2 mg光谱级KBr匀浆，压成13 mm透明片。FTIR光谱在4000–400 cm⁻¹范围内以4 cm⁻¹分辨率记录。分析对照和As(III)处理样品之间特征吸收峰的差异，以鉴定与金属暴露相关的官能团组成和生物分子结构变化（Roy et al., 2024）。
【数据】As(III)浓度：100 µg/mL；培养温度：37°C；培养时间：48 h；转速：120 rpm；离心：6000 rpm、15 min、4°C；洗涤缓冲液：0.1 M PBS（pH 7.4），3次；样品量：1 mg细菌粉末+0.2 mg KBr；压片直径：13 mm；光谱范围：4000–400 cm⁻¹；分辨率：4 cm⁻¹；仪器：PerkinElmer FT-IR
#### 2.3.4 As(III)对细菌生长模式的影响
使用96孔微孔板中的分批培养试验评估As(III)对枯草芽孢杆菌ULB16生长的影响。简言之，使用新鲜培养物中OD₆₀₀为0.1的细菌接种物进行试验。每孔含200 µL无菌最小盐培养基（MSM），补充100 µg/mL浓度的As(III)。向每孔加入100 µL标准化细菌接种物。MSM中的细菌培养物（不含砷）作为阴性对照，补充As(III)的MSM作为阳性对照。试验设三重复，微孔板在37 °C培养48 h。使用BioTek Synergy H1孔板读数仪每2 h测量光密度（OD₆₀₀）原位监测细菌生长。通过绘制OD₆₀₀值对培养时间的生长曲线，随后计算生长速率和世代时间（Rodríguez-Castrejón et al., 2025）。
【数据】接种物OD₆₀₀：0.1；每孔体积：200 µL MSM+100 µL接种物；As(III)浓度：100 µg/mL；温度：37°C；时间：48 h；检测间隔：每2 h；检测波长：600 nm；重复数：3；仪器：BioTek Synergy H1
2.4 As(III)对枯草芽孢杆菌ULB16最低抑制浓度（MIC）的测定
使用96孔微孔板试验测定As(III)对枯草芽孢杆菌ULB16的最低抑制浓度（MIC），完全抑制可见细菌生长的最低砷浓度即为MIC（Novello et al., 2024）。简言之，细菌菌株在10 mL MSM培养基中、120 rpm、37 °C振荡培养12–14 h。过夜细菌培养物用无菌MSM培养基稀释至OD₆₀₀为0.1。将稀释培养物（100 μL）加入含200 μL无菌MSM的孔中，MSM含不同浓度（1–25 mg/mL）的亚砷酸钠（NaAsO₂）。补充亚砷酸钠的MSM用作阳性对照，不含亚砷酸钠的MSM中细菌培养物用作阴性对照。实验设三重复。微孔板在37 °C、120 rpm振荡培养48 h。使用BioTek Synergy H1微孔板读数仪测量光密度（OD₆₀₀）定量细菌生长。
【数据】培养基：MSM；培养体积：10 mL；预培养：120 rpm、37°C、12–14 h；接种OD₆₀₀：0.1；As(III)浓度范围：1–25 mg/mL；每孔：100 μL培养物+200 μL MSM；温度：37°C；时间：48 h；转速：120 rpm；重复数：3；检测波长：600 nm；仪器：BioTek Synergy H1
2.5 As(III)对枯草芽孢杆菌ULB16最低杀菌浓度（MBC）的测定
将细菌分离株在补充亚砷酸钠（NaAsO₂）的最小盐培养基（MSM）中培养，浓度等于和高于所测MIC（12 mg/mL–50 mg/mL），含As(III)但不接种细菌的MSM作为阴性对照。含不同实验样品的微孔板置于轨道摇床中，37 °C、120 rpm培养48 h。使用BioTek Synergy H1微孔板读数仪测量光密度（OD₆₀₀）测定细菌生长密度。随后，将上述所有As(III)处理样品0.1 mL点种在不含As(III)的营养琼脂平板上，37 °C过夜培养。细菌在营养琼脂平板上不显示任何生长的浓度即视为该芽孢杆菌对As(III)的最低杀菌浓度（MBC）（Roy et al., 2024）。
【数据】培养基：MSM；As(III)浓度范围：12–50 mg/mL；温度：37°C；时间：48 h；转速：120 rpm；点种体积：0.1 mL；验证培养基：营养琼脂（不含As(III)）；过夜培养温度：37°C；检测波长：600 nm；仪器：BioTek Synergy H1
2.6 pH对As(III)抗性的影响
为评估该菌株在不同环境pH条件下维持砷抗性的能力，从而评估其在波动的自然和污染环境中的潜在应用生理适应性，使用96孔微孔板试验研究pH对枯草芽孢杆菌ULB16 As(III)抗性的影响。将最小盐培养基（MSM）调节至pH 4至11。每孔含……（原文此处节选截断）
【数据】pH范围：4–11；培养基：MSM；原文未详述后续步骤
研究结果
3.1 枯草芽孢杆菌ULB16的重金属抗性潜力
对该分离株进行了针对一组重金属的抗性筛选，包括砷（砷酸盐As(V)、亚砷酸盐As(III)）、铜、汞、铅、镉和铬，每种浓度均为100 µg/mL。该菌株对As(V)、As(III)、铜和镉表现出抗性，而对汞、铅和铬敏感（补充表1）。该筛选在共同暴露浓度下初步评估了ULB16对所选金属的抗性。观察到的对测试金属的差异抗性表明，ULB16的响应因金属种类而异，这可能反映了它们物理化学性质及其与细菌细胞相互作用的差异。类似的选择性金属抗性模式已在环境芽孢杆菌分离株中有报道（Patil et al., 2024）。先前研究还表明，生物膜形成可通过限制金属穿透胞外基质来促进细菌在重金属胁迫下的存活（Maity et al., 2023）。在测试的重金属中，对As(V)和As(III)的双重抗性尤其值得关注，因为这两种砷形态在化学性质和毒性上差异显著。鉴于As(III)的高毒性、迁移性和环境意义，选择其进行后续详细研究。因此后续实验聚焦于测定ULB16在As(III)胁迫下的生长响应、砷去除能力和转化潜力。
【数据】金属浓度：100 µg/mL；抗性金属：As(V)、As(III)、铜、镉；敏感金属：汞、铅、铬；菌株：枯草芽孢杆菌ULB16
3.2 As(III)胁迫下枯草芽孢杆菌ULB16的生长响应和形态适应
#### 3.2.1 对细菌菌落形态的影响
在含（100 µg/mL）和不含亚砷酸钠的MSM琼脂平板上检查枯草芽孢杆菌ULB16的菌落形态。在无As(III)条件下，菌落大、干燥、不规则，呈现高度分支的边缘，这是形成生物膜的芽孢杆菌形态型的特征（图1A）。相反，在补充As(III)的MSM琼脂上生长的菌落更小、更紧凑、更光滑，外周分支减少，并伴有明显的褐色色素沉着（图1B）。观察到的菌落形态改变表明As(III)暴露诱导了枯草芽孢杆菌ULB16的生理变化，导致菌落结构和色素沉着的改变。类似的形态响应已在暴露于重金属胁迫的细菌中有报道，被认为是增强不利环境条件下存活的适应性策略（Angelini et al., 2023）。
【数据】As(III)浓度：100 µg/mL；培养基：MSM琼脂；温度：37°C；时间：48 h；对照组菌落特征：大、干燥、不规则、高度分支；处理组菌落特征：小、紧凑、光滑、分支减少、褐色色素沉着
#### 3.2.2 对细菌细胞形态的影响
进行场发射扫描电子显微镜（FE-SEM）观察暴露于As(III)（100 µg/mL）的细菌细胞的超微结构改变。在无As(III)培养基中生长的芽孢杆菌细胞呈现光滑、完整、杆状形态，边界清晰，表面质地均匀，为健康芽孢杆菌细胞的典型特征（图1C）。细胞被膜显得紧凑完整，无可见表面不规则或变形。相反，在含As(III)培养基中生长的细胞（图1D）显示明显的形态不规则。细胞表面粗糙、皱褶、不平整，可见凹陷和不对称轮廓。部分细胞在末端或中部出现肿胀，而另一些则显得伸长或聚集，表明可能存在细胞壁增厚或部分塌陷。这些超微结构变化表明As(III)暴露改变了细菌细胞被膜的完整性，导致细胞形态改变。类似的形态损伤已在暴露于砷和其他重金属的细菌中有报道，被认为是金属诱导胁迫的常见细胞响应，由细胞被膜结构和膜功能破坏引起（Pandey and Bhatt, 2015）。
【数据】As(III)浓度：100 µg/mL；培养温度：37°C；时间：48 h；对照组细胞：光滑、完整、杆状；处理组细胞：粗糙、皱褶、凹陷、不对称、肿胀/伸长/聚集；仪器：FE-SEM
#### 3.2.3 As(III)对细胞表面官能团的影响：FTIR分析
枯草芽孢杆菌ULB16在暴露于100 µg/mL As(III)前后的FTIR光谱显示，对应主要细胞官能团的吸收带发生明显变化（补充图S1）。在对照中，芽孢杆菌细胞未暴露于砷胁迫，在3276.8 cm⁻¹、2921.8 cm⁻¹、1639.2 cm⁻¹、1542.7 cm⁻¹、1396.2 cm⁻¹和1054.9 cm⁻¹处观察到显著峰，分别对应蛋白质和多糖的-OH/-NH伸缩振动、脂肪链的CH伸缩振动、蛋白质酰胺I和II振动、CH弯曲振动和碳水化合物的CO伸缩振动（Naumann, 2000; Pagnucco et al., 2023）。暴露于As(III)后，这些峰分别移动至3286.3 cm⁻¹、2923.3 cm⁻¹、1636.1 cm⁻¹、1536.5 cm⁻¹、1398.5 cm⁻¹和1058.6 cm⁻¹，并伴有明显的谱带强度变化。微生物对As(III)的生物吸附涉及细胞壁组分如多糖、脂质和蛋白质。这些组分含有金属结合官能团，包括羧基、羟基、硫酸基、磷酸基和氨基（Sher et al., 2022; Vishnoi et al., 2014）。在ULB16中，观察到的–OH/–NH、酰胺和碳水化合物相关区域的位移表明As(III)暴露后这些细胞表面官能团的化学环境发生变化。特别是羟基、氨基/酰胺和磷酸基团的变化表明亚砷酸盐与膜相关蛋白、多糖或脂质组分之间存在相互作用。类似的FTIR光谱修饰已在砷抗性芽孢杆菌菌株中有报道，被认为指示细胞表面生物分子参与金属吸附和解毒过程（Ghosh et al., 2018）。尽管观察到的峰位移相对较小，但在主要官能团中保持一致，表明亚砷酸盐暴露后细菌细胞被膜发生了微妙的结构重排。总体而言，菌落形态、FE-SEM和FTIR分析表明，As(III)暴露诱导了枯草芽孢杆菌ULB16协调的生理和结构响应。菌落尺寸减小、细胞形态改变和表面官能团修饰共同表明，细菌细胞被膜是暴露早期与As(III)相互作用的主要位点。这些适应性变化可能通过改变细胞表面的物理化学性质来促进As(III)耐受，从而支持枯草芽孢杆菌ULB16在砷胁迫下的存活，并凸显其砷生物修复潜力。
【数据】As(III)浓度：100 µg/mL；对照峰位：3276.8、2921.8、1639.2、1542.7、1396.2、1054.9 cm⁻¹；处理峰位：3286.3、2923.3、1636.1、1536.5、1398.5、1058.6 cm⁻¹；光谱范围：4000–400 cm⁻¹；分辨率：4 cm⁻¹
#### 3.2.4 As(III)胁迫对枯草芽孢杆菌ULB16生长动力学的影响
枯草芽孢杆菌ULB16在100 µg/mL As(III)存在下的生长曲线显示，该菌株能有效耐受As(III)胁迫并在整个培养期间维持活跃生长（补充图S2）。细菌在短暂滞后期后成功进入指数期，表明其适应As(III)诱导胁迫条件的能力。尽管As(III)胁迫下的生长速率略低于对照，但整个培养期间生物量的持续增加表明As(III)的抑制作用并未阻止细菌增殖。ULB16在As(III)存在下维持持续生长的能力反映了其对砷胁迫的生理适应。类似的生长模式已在砷抗性芽孢杆菌物种中有报道，其中初始滞后期之后，随着细菌细胞适应有毒环境并恢复细胞稳态，出现活跃生长（Kushwaha et al., 2025）。观察到的生长行为……（原文此处节选截断）
【数据】As(III)浓度：100 µg/mL；培养温度：37°C；时间：48 h；原文未详述具体生长速率和世代时间数值
讨论与解读
本研究通过生理、显微、光谱和分析方法的整合，揭示了海洋大型藻内生菌枯草芽孢杆菌ULB16的砷解毒行为。该菌株展现出显著的砷耐受性，MIC达12 mg/mL，可在pH 4–11和28–45 °C范围内维持生长。As(III)暴露诱导了菌落形态、细胞表面超微结构和细胞被膜相关官能团的明显改变，表明适应性细胞响应。ICP-MS分析显示胞内砷积累极低，大部分去除的砷从生物量表面回收，提示表面相关相互作用在砷去除中起重要作用。水培试验进一步证明了这些解毒能力的功能意义，细菌处理显著缓解了As(III)诱导的植物毒性。全基因组测序鉴定出多个砷抗性相关基因，包括arsR、arsB、arsC、czrA和cotA，为观察到的砷耐受性提供了分子基础。这些发现共同表明，ULB16具有多重砷抗性特征，是生物砷修复的有前景候选菌株。
编译者解读
该研究从海洋大型藻内生菌中挖掘砷抗性资源，思路值得借鉴——海洋环境来源的微生物往往具备独特的金属适应机制。ULB16的12 mg/mL MIC和80%去除率在已报道的砷抗性芽孢杆菌中处于较高水平，且胞内积累极低、以表面吸附为主的去除模式降低了二次暴露风险。基因组鉴定到的arsR-arsC-arsB操纵子与cotA（推测为多铜氧化酶，可能参与As(III)氧化）构成了较完整的抗性-转化网络。局限在于：水培实验周期仅7天，未评估田间土壤复杂基质中的定殖与修复效果；As(III)氧化仅为定性验证，缺乏酶动力学数据。后续可聚焦cotA的异源表达与定向改造，并开展盆栽或田间验证。
参考来源
期刊：Journal of Hazardous Materials Advances, 2026
DOI: 10.1016/j.hazadv.2026.101536
DOI: 10.1016/j.hazadv.2026.101536