来源：Spore surface display of Chinook salmon bafinivirus (CSBV) nucleoprotein in Bacillus subtilis as an oral vaccine candidate for Japanese flounder Paralichthys olivaceus（Fish & Shellfish Immunology）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
牙鲆养殖业正遭受鲑鱼双链RNA病毒（CSBV）的严重威胁，目前尚无有效防治手段。本研究将CSBV核蛋白（N）基因与枯草芽孢杆菌芽孢衣壳蛋白CotC锚定基因融合，构建了两种重组芽孢口服疫苗候选株——保留CotC终止密码子的B.s-CotC(TAA)-CSBV N与删除终止密码子的B.s-CotC(ΔTAA)-CSBV N。结果显示，只有删除终止密码子才能实现全长融合蛋白的表面展示，并诱导牙鲆产生系统性抗体应答。重组芽孢可穿越胃肠道屏障，定位于肠道、脾脏和肾脏。4°C储存4周后仍保留约60%免疫反应性。
研究背景
牙鲆是中国、日本和韩国广泛养殖的经济鱼种。随着养殖规模扩大和密度增加，微生物病原引发的疾病显著增多。其中，CSBV感染近年来发病率持续上升，给产业造成重大经济损失，而目前尚无有效的预防或治疗措施。CSBV基因组包含五个开放阅读框，分别编码ORF1a、ORF1b、刺突蛋白（S）、膜蛋白（M）和核蛋白（N）。多种病毒的S蛋白高度易变，使病毒容易逃逸宿主免疫监视。对于同时编码S和N蛋白的类似病毒，积累的临床前和临床证据表明，N蛋白疫苗可诱导与S蛋白疫苗相当的免疫保护，且免疫持久性更长。据此，开发靶向CSBV N蛋白的疫苗是预防CSBV的合理策略。大量研究和田间试验已证实，疫苗接种是预防养殖水产经济病原的有效手段。枯草芽孢杆菌芽孢表面展示技术能将外源抗原稳定表达于芽孢表面，增强宿主特异性免疫系统的识别，为水产口服疫苗开发提供了有力的技术支撑。
研究方法
2.1 伦理声明
所有动物实验均按照中华人民共和国《实验动物—动物福利伦理审查指南》（GB/T 35892-2018）执行。伦理审批由河北北戴河中心实验站动物伦理委员会批准（批准号：202401-001）。
【数据】标准编号：GB/T 35892-2018；批准号：202401-001；审批机构：北戴河中心实验站动物伦理委员会
2.2 重组质粒构建与质粒转化
为构建涉及CotC(TAA)和CotC(ΔTAA)的基因融合体，首先从枯草芽孢杆菌MATE01（春尧生物科技有限公司，中国）中扩增完整CotC基因并测序。根据终止密码子序列的有无，确定pMATE01-CotC(TAA)和pMATE01-CotC(ΔTAA)的插入片段序列。CSBV N的编码序列来自本实验室前期测序结果（GenBank登录号：OM830952）。所有插入片段序列确认后，由赛索飞生物科技有限公司（中国）合成重组质粒，最终构建了四个质粒：pMATE01-CotC(TAA)、pMATE01-CotC(ΔTAA)、pMATE01-CotC(TAA)-CSBV N和pMATE01-CotC(ΔTAA)-CSBV N（图1）。为便于高效追踪各重组片段的表达，在每个质粒插入片段的起始密码子（ATG）下游直接引入His标签或Flag标签，如图1B所示。将重组质粒导入枯草芽孢杆菌感受态细胞，在卡那霉素琼脂平板上筛选阳性克隆。使用pMATE01质粒通用引物F（5′-ATTTTATTCTTGCTGAGTCTGGC-3′）和R（5′-AACCATCACCCTAATCAAGTTTT-3′）进行PCR验证，随后测序确认。
【数据】菌株：枯草芽孢杆菌MATE01；质粒数：4个；标签：His-tag、Flag-tag；抗生素：卡那霉素；GenBank登录号：OM830952；引物F序列：5′-ATTTTATTCTTGCTGAGTCTGGC-3′；引物R序列：5′-AACCATCACCCTAATCAAGTTTT-3′
2.3 重组芽孢制备
通过营养耗尽法在Difco芽孢形成培养基（DSM）中获得重组枯草芽孢杆菌MATE01菌株的芽孢，37°C培养24 h。培养结束后收集芽孢，进行三次洗涤循环，随后用2 mg/mL溶菌酶在37°C处理2 h。处理后用PBS洗涤3次，弃上清获得纯化芽孢。芽孢悬液调整至10⁸ spores/mL浓度，4°C保存。
【数据】培养基：DSM；温度：37°C；时间：24 h；溶菌酶浓度：2 mg/mL；溶菌酶处理温度：37°C；溶菌酶处理时间：2 h；PBS洗涤次数：3次；芽孢浓度：10⁸ spores/mL；保存温度：4°C
2.4 饲料制备与口服免疫
从中国水产科学研究院北戴河中心实验站获取体重500-600g的健康牙鲆，在水温（22 ± 1 °C）条件下养殖，每日投喂两次。鱼体暂养7 d后随机分配至五个3000 L水槽。设立五组（每组n = 20），分别命名为pMATE01、pMATE01-CotC(TAA)、pMATE01-CotC(ΔTAA)、pMATE01-CotC(TAA)-CSBV N和pMATE01-CotC(ΔTAA)-CSBV N。每组接受添加相应重组芽孢的饲料，每日提供100 g商业饲料（粤群，#C9，中国），含10¹⁰个重组枯草芽孢杆菌芽孢。
【数据】鱼体重：500-600g；水温：22 ± 1 °C；投喂频率：每日2次；暂养时间：7 d；水槽体积：3000 L；每组鱼数：n = 20；每日饲料量：100 g；饲料品牌：粤群 #C9；芽孢含量：10¹⁰ spores/100g饲料
2.5 免疫与样品采集
口服给药实验持续四周。每周第1、3、5天进行三次免疫（图5A）。免疫阶段，五组分别口服喷洒了五种不同芽孢类型的饲料。所有组接受鱼体重1%的饲料量，每日投喂两次。口服给药后28 d采集样品。每组解剖5条鱼收集样品，包括血液、肠道、脾脏和肾脏组织。血液样品在4°C过夜凝固，随后在4°C、5000 rpm离心20 min收集血清。血清保存于−80°C用于后续ELISA分析。其余组织同样保存于−80°C以备后续分析。
【数据】实验周期：4周；免疫天数：每周第1、3、5天；投喂量：鱼体重1%；每日投喂次数：2次；采样时间：口服给药后28 d；每组采样鱼数：5条；血液凝固温度：4°C；凝固时间：过夜；离心条件：4°C、5000 rpm、20 min；保存温度：−80°C
2.6 芽孢肠道定植检测
四周口服给药实验结束后，从每组随机选取5条鱼，切取1 cm长的肠道片段。在进行进一步处理前，收集的肠道样品用PBS仔细冲洗三次以去除表面污染物和残留饲料颗粒。使用TIAamp海洋动物DNA试剂盒（DP324，天根生化，中国）提取基因组DNA，设计针对CSBV N靶位点两侧的特异性引物（F：5′-ATGGCATTCTACGGACAACC-3′；R：5′-TTACTCAGTCGAGGAAACATGAAA-3′），使用2 × Hieff PCR Master Mix（10102ES03，YEASEN，中国）通过PCR扩增含靶位点的基因片段。PCR扩增条件：94°C预变性5 min；35个循环的94°C变性30 s、55°C退火30 s、72°C延伸30 s；最终72°C延伸10 min。PCR产物通过琼脂糖凝胶电泳验证并测序。
【数据】肠道片段长度：1 cm；每组采样鱼数：5条；PBS冲洗次数：3次；DNA提取试剂盒：TIAamp Marine Animals DNA Kit（DP324）；PCR试剂：2 × Hieff PCR Master Mix（10102ES03）；预变性：94°C、5 min；循环数：35；变性：94°C、30 s；退火：55°C、30 s；延伸：72°C、30 s；最终延伸：72°C、10 min；引物F：5′-ATGGCATTCTACGGACAACC-3′；引物R：5′-TTACTCAGTCGAGGAAACATGAAA-3′
2.7 蛋白质印迹
重组枯草芽孢杆菌MATE01菌株的芽孢用蛋白上样缓冲液在100°C处理10 min，然后直接在12% SDS-PAGE上分离，转移至0.2 μm聚偏二氟乙烯（PVDF）膜（Millipore，美国）进行蛋白质印迹。用QuickBlock™ Western封闭缓冲液（P0252-500 ml，碧云天，中国）封闭后，分别将膜样品与单独的一抗在4°C过夜孵育，稀释比1:4000。本实验所用一抗包括抗His标签兔单抗（AE086，ABclonal，中国）、抗Flag标签兔单抗（PTM-5577，PTM BIO，中国）和抗CSBV N兔多抗（自制，1 mg/ml）。所有膜随后用PBST洗涤五次，然后与HRP偶联二抗（111-035-003，Jackson ImmunoResearch，美国）以1:10000稀释比孵育。最后，使用增强化学发光（ECL）法（AIWB-006，Affinibody，中国）可视化免疫反应条带。
【数据】芽孢处理温度：100°C；处理时间：10 min；SDS-PAGE浓度：12%；PVDF膜孔径：0.2 μm；封闭液：QuickBlock™ Western Blocking Buffer；一抗稀释比：1:4000；一抗孵育温度：4°C；孵育时间：过夜；PBST洗涤次数：5次；二抗稀释比：1:10000；ECL试剂：AIWB-006；抗His抗体货号：AE086；抗Flag抗体货号：PTM-5577；抗CSBV N抗体浓度：1 mg/ml
2.8 免疫荧光
预处理后，样品固定于载玻片上，用3%牛血清白蛋白（BSA）封闭30 min。使用TSA多重荧光染色试剂盒（G1236-50T，Servicebio，中国）按照制造商方案进行多重免疫荧光染色。为便于在同一样品切片中检测多种生物标志物，采用顺序循环染色流程。该流程包括重复循环的一抗孵育、HRP偶联二抗孵育、TSA信号放大和抗体复合物洗脱。用于循环多重染色的一抗包括抗His标签兔单抗（稀释1:5000，GB151255，Servicebio，中国）、抗Flag标签鼠单抗（稀释1:5000，GB15938，Servicebio，中国）和抗CSBV N兔多抗（稀释1:2000，自制，1 mg/mL）。根据上述一抗的抗体类型，选择相应的二抗，包括HRP偶联山羊抗小鼠IgG（稀释1:500，GB23301，Servicebio，中国）和HRP偶联山羊抗兔IgG（稀释1:500，GB23303，Servicebio，中国）。简言之，在每个染色循环中，载玻片在湿盒中与单一类型一抗在4°C过夜孵育。随后，切片用PBST彻底洗涤3∼5次，然后与HRP偶联二抗在室温孵育。接着，在暗处应用相应的荧光TSA工作液以增强信号。TSA信号显色后，使用抗体洗脱液完全洗脱抗体复合物以终止当前染色循环并去除任何残留的免疫反应信号。载玻片随后用3% BSA重新封闭，并按相同染色程序依次对其余两种一抗进行染色。
【数据】BSA浓度：3%；封闭时间：30 min；TSA试剂盒：G1236-50T；抗His抗体稀释比：1:5000；抗Flag抗体稀释比：1:5000；抗CSBV N抗体稀释比：1:2000；抗His抗体货号：GB151255；抗Flag抗体货号：GB15938；HRP-山羊抗小鼠IgG稀释比：1:500；HRP-山羊抗兔IgG稀释比：1:500；一抗孵育温度：4°C；孵育时间：过夜；PBST洗涤次数：3∼5次；二抗孵育温度：室温
研究结果
3.1 口服芽孢的制备与验证
枯草芽孢杆菌MATE01的产孢能力此前未见报道。本研究中，我们证明MATE01菌株（图2A）在DSM培养基中诱导24 h后可高效形成芽孢（图2B）。从五个含pMATE01质粒的重组枯草芽孢杆菌克隆中分离芽孢，使用pMATE01通用引物进行PCR扩增，获得单一预期分子大小的扩增子（图2C）。Sanger测序确认了扩增片段的身份，从而验证了芽孢中质粒的维持，适用于口服递送。
【数据】诱导时间：24 h；培养基：DSM；重组克隆数：5个；PCR扩增子：单一预期大小条带；测序方法：Sanger测序
3.2 枯草芽孢杆菌MATE01芽孢中CSBV N表达的蛋白质印迹分析
CotC + CSBV N融合蛋白的分子量估计约为33.17 kDa，其中CSBV N为20.75 kDa，CotC为12.44 kDa。芽孢裂解物的蛋白质印迹分析获得以下观察结果（图3）：（i）如预期，pMATE01空载体对照中未检测到免疫反应条带（泳道1）。（ii）pMATE01-CotC(TAA)菌株显示单一的His反应条带，对应CotC（泳道2），与天然终止密码子处的翻译终止一致。（iii）pMATE01-CotC(ΔTAA)菌株也产生His反应的CotC条带；但其分子量略高，并观察到若干次要条带（泳道3），表明终止密码子删除导致通读翻译。（iv）值得注意的是，pMATE01-CotC(TAA)-CSBV N菌株同时显示His反应的CotC条带和迁移至游离CSBV N理论分子量的Flag条带。然而，该推定CSBV N大小的条带与抗CSBV N抗体无免疫反应性（泳道4）。（v）pMATE01-CotC(ΔTAA)-CSBV N菌株产生对应全长CotC-CSBV N融合蛋白的His和Flag反应条带，该条带也被抗CSBV N抗体识别。此外，该样品中与推定CSBV N大小一致的条带对anti-Flag和anti-CSBV N抗体均显示阳性免疫反应性（泳道5）。
【数据】融合蛋白分子量：约33.17 kDa；CSBV N分子量：20.75 kDa；CotC分子量：12.44 kDa；泳道1：pMATE01空载体（无条带）；泳道2：pMATE01-CotC(TAA)（单一His条带）；泳道3：pMATE01-CotC(ΔTAA)（His条带+次要条带）；泳道4：pMATE01-CotC(TAA)-CSBV N（His条带+Flag条带，抗CSBV N无反应）；泳道5：pMATE01-CotC(ΔTAA)-CSBV N（His+Flag+抗CSBV N阳性条带）
3.3 芽孢表面CSBV N的鉴定
pMATE01-CotC(ΔTAA)-CSBV N重组芽孢的免疫荧光分析显示，抗CSBV N、抗His和抗Flag抗体产生连续的环状荧光信号，环绕DAPI染色的核心（图4）。三个通道荧光信号的完全重叠表明CotC-His和CSBV N-Flag在这些重组芽孢表面的共定位，从而证实CSBV N蛋白的正确折叠和表面暴露，可被CSBV N特异性抗血清识别。
【数据】荧光信号形态：连续环状；三通道信号：完全重叠；DAPI染色：核心；抗体：抗CSBV N、抗His、抗Flag
3.4 口服重组枯草芽孢杆菌芽孢的功效评估
给药后28 d，提取肠道DNA并通过PCR分析。在pMATE01-CotC(TAA)-CSBV N和pMATE01-CotC(ΔTAA)-CSBV N组中均检测到对应CSBV N编码序列的扩增子，表明芽孢成功定植肠道（图5B）。为进一步评估疫苗诱导的免疫应答，对IgM基因表达进行定量分析。结果显示，B.s-CotC(ΔTAA)-CSBV N组脾脏中IgM表达显著升高。然而，在肠道和肾脏中，仅部分个体显示IgM表达增加，其余个体无明显变化，表明存在较大的个体差异。这些结果共同表明，缺乏CotC终止密码子的疫苗构建体能有效触发免疫应答（图5C）。为确定检测到的DNA信号是否转化为功能性抗原表达，使用免疫后收集的免疫血清作为包被抗原，在间接ELISA中定量CSBV N特异性抗体水平。含CotC终止密码子的芽孢（B.s-CotC(TAA)-CSBV N）未引发可检测的抗体应答，而缺乏终止密码子的芽孢（B.s-CotC(ΔTAA)-CSBV N）诱导了强健的抗原特异性抗体滴度（图5D）。因此，仅在肠道中检测到CSBV N编码DNA不足以产生免疫原性；去除CotC终止密码子以实现全长翻译，是产生抗原特异性抗体应答的必要条件。
【数据】检测时间：给药后28 d；PCR阳性组：pMATE01-CotC(TAA)-CSBV N和pMATE01-CotC(ΔTAA)-CSBV N；IgM显著升高组织：脾脏（B.s-CotC(ΔTAA)-CSBV N组）；肠道和肾脏：部分个体升高，个体差异大；ELISA结果：B.s-CotC(TAA)-CSBV N组无抗体应答，B.s-CotC(ΔTAA)-CSBV N组强抗原特异性抗体滴度
3.5 口服芽孢给药后靶蛋白CSBV N的体内积累与组织定位
为评估重组芽孢（B.s-CotC(ΔTAA)-CSBV N）通过口服给药向牙鲆递送CSBV N抗原的功效，以及表征其体内分布，使用CSBV特异性抗体进行免疫荧光测定。绿色荧光信号的定位和强度作为靶蛋白空间分布和积累水平的指标。通过绿色荧光强度定性评估空间分布和蛋白积累。给药后28天，在肠道、脾脏和肾脏中鉴定到特异性CSBV N蛋白信号（图6），证实其系统性播散至关键免疫相关器官。这确认了B.s-CotC(ΔTAA)-CSBV N重组芽孢口服给药后可穿越胃肠道屏障。这促进了CSBV N抗原蛋白的系统性递送，导致其在关键免疫相关组织中的系统性积累。肠道黏膜内的弥散荧光证实了抗原的广泛局部分布，与肠道作为口服疫苗初始相互作用部位的功能一致。在脾脏中，信号局限于白髓边缘区周围。白髓内无信号表明，尽管CSBV N蛋白到达了脾脏区室，但其被实质细胞摄取有限，导致边缘区内的局灶性积累。肾脏的免疫荧光分析显示，CSBV N蛋白主要被隔离在肾小球内，形成界限清晰的荧光团簇。相反，肾小管区室仅显示可忽略的弥散信号，表明肾小管中缺乏靶蛋白的定向积累。
【数据】检测时间：给药后28天；阳性组织：肠道、脾脏、肾脏；肠道分布：黏膜弥散荧光；脾脏分布：白髓边缘区（白髓内无信号）；肾脏分布：肾小球（形成荧光团簇），肾小管信号可忽略
3.6 重组枯草芽孢杆菌芽孢稳定性
同一批次B.s-CotC(ΔTAA)-CSBV N芽孢分装后分别储存于4°C和25°C。在第0、1、2、3、4周使用抗CSBV N抗体进行蛋白质印迹分析，检测CSBV N蛋白的相对含量（图7A）。条带灰度值定量分析表明，两组间CSBV N蛋白的衰减速率差异显著（图7B）。在4°C下，CSBV N蛋白相对含量在第1周时接近初始水平的80%，第4周时保留约60%。在25°C下，相对含量在第1周时降至50%以下，第4周时进一步降至约20%。
【数据】储存温度：4°C和25°C；检测时间点：0、1、2、3、4周；4°C第1周：约80%；4°C第4周：约60%；25°C第1周：低于50%；25°C第4周：约20%
讨论与解读
水产养殖中创新、安全、有效的疾病防控方法一直是关键挑战。近年来，非侵入性疫苗研究势头强劲，甚至有学者通过基因修饰皮肤微生物群开发了新型局部涂抹疫苗。在水产养殖中，益生菌作为疫苗载体的应用已得到大量实验验证。枯草芽孢杆菌表面展示技术擅长将外源抗原稳定表达于芽孢表面，显著增强宿主特异性免疫系统的识别，为水产口服疫苗开发提供了有力的技术支撑。芽孢表面展示涉及将抗原基因与芽孢衣壳锚定蛋白编码序列融合，转化入芽孢杆菌后，抗原稳定展示于芽孢表面，受益于芽孢的环境耐受性实现有效递送。锚定蛋白的选择和基因修饰（如终止密码子处理）显著影响展示效率和疫苗效果。
本研究的关键发现是：CotC终止密码子的去除是实现全长融合蛋白表达和稳定锚定的必要条件。保留终止密码子的构建体虽能检测到CSBV N编码DNA，但未能引发可检测的抗体应答；而删除终止密码子的构建体诱导了强健的抗原特异性抗体滴度。重组芽孢可穿越胃肠道屏障，在肠道、脾脏和肾脏中积累，但脾脏白髓内无信号，提示抗原被实质细胞摄取有限，这可能与免疫应答欠佳有关。芽孢在4°C下稳定性良好，4周后仍保留约60%免疫反应性。
编译者解读
该研究在方法层面展示了一个经典且实用的芽孢表面展示策略——通过终止密码子删除实现锚定蛋白与抗原的全长融合。这一细节看似微小，却是决定疫苗成败的关键。研究者的组织定位数据揭示了口服疫苗的一个核心瓶颈：抗原虽能到达脾脏，却被阻挡在白髓之外，限制了免疫应答的强度。从合成生物学视角看，未来可通过优化锚定蛋白、引入靶向配体或佐剂共展示来突破这一屏障。此外，4°C下60%的4周保留率尚可，但距实用化仍有提升空间。
参考来源
期刊：Fish & Shellfish Immunology, 2026
DOI: 10.1016/j.fsi.2026.111426
DOI: 10.1016/j.fsi.2026.111426