来源：Response Surface Optimization for enhanced keratinase production from Bacillus vallismortis Gz4 isolated from poultry farm of Ghaziabad and its antifungal activity（Biocatalysis and Agricultural Biotechnology）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
角蛋白废弃物（羽毛、毛发、羊毛等）在全球家禽和皮革工业中大量堆积，因其二硫键高度交联而难以被普通蛋白酶降解。本研究从印度加济阿巴德家禽养殖场土壤中分离到一株高产角蛋白酶的芽孢杆菌Gz4，经16S rRNA测序鉴定为Bacillus vallismortis。通过OVAT与响应面法（RSM）联合优化，角蛋白酶活性从初始3.64 U/ml提升至24.97 U/ml，提高1.3倍。粗酶液对镰刀菌和毛霉均表现出显著抗真菌活性，提示其在农业生物防治中的应用潜力。
研究背景
羽毛、毛发、羊毛和指甲等角蛋白废弃物是全球家禽与皮革工业产生的大量富蛋白固体废弃物的主要组成部分。这些废弃物以角蛋白为主——一种纤维状、高度交联的结构蛋白，因二硫键、氢键和疏水相互作用的存在，对普通蛋白水解酶具有抗性。角蛋白酶是一类特殊的蛋白水解酶，能够分解这些不溶性角蛋白物质，且主要在角蛋白底物存在时表现出活性。家禽养殖场产生大量富角蛋白废弃物（主要是羽毛），若管理不当将造成环境污染。
角蛋白酶主要由来自富角蛋白环境（如家禽养殖场土壤、羽毛堆放场和制革废水）的某些细菌和真菌产生。已有研究从家禽养殖场土壤中分离到产角蛋白酶的Pangasianodon hypophthalmus。最突出的角蛋白酶产生菌包括革兰氏阳性菌，如芽孢杆菌属的多个种——B. subtilis、B. pumilus、B. licheniformis、B. tropicus和B. cereus等，因其酶活性强、热稳定性好且能胞外分泌而备受关注。
研究方法
2.1 化学试剂
本研究使用的所有化学试剂均购自Sigma Chemicals Co.（美国）、TCI（日本）和Hi-Media Mumbai（印度）。所有试剂均为分析纯。
【数据】试剂来源：Sigma（美国）、TCI（日本）、Hi-Media（印度）；纯度：分析纯；原文未详述具体试剂清单
2.2 方法
#### 2.2.1 土壤样品采集
土壤样品从喜马偕尔邦、北方邦、哈里亚纳邦和德里不同地理区域的家禽养殖场和鸟类保护区无菌采集。去除表层2–4 cm土壤后，使用无菌铲从5–8 cm深度采集约10 g土壤，转移至预灭菌袋中。
【数据】采样深度：去除2–4 cm表层，采集5–8 cm深度；样品量：约10 g；采样地点：喜马偕尔邦、北方邦、哈里亚纳邦、德里
#### 2.2.2 产角蛋白酶细菌的分离
产角蛋白酶细菌的分离采用富集和梯度稀释法，参照EI-Fadaly等（2002）所述方法进行。
【数据】方法：富集+梯度稀释法；参考文献：EI-Fadaly et al., 2002；原文未详述具体稀释倍数和富集培养基组成
#### 2.2.3 产角蛋白酶细菌的初筛
对通过富集和梯度稀释初步获得的细菌分离株进行初筛，以鉴定在37°C下脱脂牛奶琼脂培养基上具有蛋白水解活性的菌株。使用组成为脱脂牛奶2.8%（w/v）、胰蛋白胨0.5%（w/v）和琼脂2%（w/v）、pH 7.5的培养基检测细菌分离株的蛋白酶活性（EI-Fadaly et al., 2002）。根据脱脂牛奶水解和脱脂牛奶琼脂（SMA）培养基透明圈的产生，选择蛋白酶阳性分离株并以纯培养形式保藏于营养琼脂上。
【数据】培养基：脱脂牛奶2.8%（w/v）、胰蛋白胨0.5%（w/v）、琼脂2%（w/v）；pH：7.5；温度：37°C；筛选依据：水解透明圈
#### 2.2.4 产角蛋白酶分离株的复筛
将角蛋白酶阳性分离株接种至角蛋白肉汤（0.5% w/v羊毛角蛋白、0.1% K₂HPO₄和0.05% MgSO₄·7H₂O，pH 8.0）中，在37°C培养48 h。使用无菌凝胶打孔器在角蛋白琼脂平板上轻轻打孔制备孔洞，用于孔扩散试验。每孔加入100 μl接种物，平板在37°C孵育48 h。随后用碘液覆盖平板，碘液作为对比试剂对未降解的角蛋白底物进行染色，从而可视化产角蛋白酶菌落周围的透明水解圈。根据透明圈直径评估分离株，选择产生最大透明圈的菌株进行后续定量酶分析。
【数据】角蛋白肉汤组成：0.5% w/v羊毛角蛋白、0.1% K₂HPO₄、0.05% MgSO₄·7H₂O；pH：8.0；培养温度：37°C；培养时间：48 h；每孔加样量：100 μl；染色试剂：碘液
#### 2.2.5 角蛋白酶产量的定量测定
角蛋白酶活性测定采用Fang等（2013）的方法并稍作修改。反应混合物包含1 ml底物（0.2 g羊毛角蛋白溶解于100 ml 50 mM Tris-HCl缓冲液中，pH 8.0）和1 ml粗酶制剂。混合物在40°C孵育1 h，加入2 ml 4%（w/v）TCA终止反应后，采用Folin-Ciocalteu法测定酶活性，在660 nm处测量吸光度。含1 ml底物（不含酶）的实验对照在相同条件下孵育，以校正非酶促释放的可溶性蛋白。所有测定均设三个重复，取平均值进行分析。
【数据】底物：0.2 g羊毛角蛋白/100 ml 50 mM Tris-HCl缓冲液；缓冲液pH：8.0；反应温度：40°C；反应时间：1 h；终止试剂：2 ml 4%（w/v）TCA；检测波长：660 nm；重复次数：3次
#### 2.2.5.1 酶活单位定义
在标准测定条件下，一个角蛋白酶活性单位（U）定义为每分钟从底物（角蛋白）中释放1 μmol酪氨酸所需的酶量（Farag and Hassan, 2004）。
【数据】酶活单位定义：每分钟释放1 μmol酪氨酸所需的酶量；参考文献：Farag and Hassan, 2004
#### 2.2.6 产角蛋白酶细菌的表征与鉴定
通过革兰氏染色和观察琼脂平板上的菌落形态，对选定细菌分离株进行形态学和生理学表征。分离株进一步在Hi-Gx360® Solutions, HiMedia Laboratories Pvt. Ltd（印度马哈拉施特拉邦）进行16S rRNA测序鉴定。通过从NCBI服务器BLAST检索近缘菌株序列确定进化历史。序列通过CLUSTALW进行多序列比对，并使用MEGA 12构建系统发育树。
【数据】鉴定方法：16S rRNA测序；测序机构：Hi-Gx360® Solutions, HiMedia Laboratories；比对工具：CLUSTALW；建树软件：MEGA 12；序列检索：NCBI BLAST
#### 2.2.7 选定细菌分离株的生长曲线
通过测量种子培养基中的生物量增长，考察细菌分离株Gz4的生长曲线。每4 h测定培养液在660 nm处的吸光度，直至72 h。10,000 rpm离心5 min后，取上清液测定角蛋白酶活性。
【数据】检测波长：660 nm；检测间隔：每4 h；总时长：72 h；离心条件：10,000 rpm，5 min
#### 2.2.8 胞外角蛋白酶生产理化条件的优化
##### 2.2.8.1 单因素一次法（OVAT）
细菌分离株Gz4提高角蛋白酶产量的初步研究在37°C、pH 7.0的微量盐培养基、120 rpm振荡条件下进行。最初，采用OVAT法优化接种龄、接种量、生产培养基、碳源、碳源浓度、氮源、氮源浓度、不同金属离子影响、金属离子浓度、温度、pH和转速等理化参数。每4 h监测选定细菌分离株的生长以确定接种龄。以不同接种量（1.0、2.0、3.0、4.0和5.0%，v/v）接种生产培养基以评估最佳接种量。为确定最适合角蛋白酶生产的培养基，配制了八种不同生产培养基（M1–M8），其碳源、氮源和角蛋白源组成不同，pH 7.0、37°C（表1）。测试了不同碳源（包括葡萄糖、蔗糖、果糖、乳糖、麦芽糖和半乳糖）以获得最大角蛋白酶活性。为最大化角蛋白酶产量，将选定碳源的不同浓度（0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6和0.7%，w/v）加入生产培养基。将不同氮源（胰蛋白胨+酵母提取物（1:1）、胰蛋白胨+肉提取物（1:1）、胰蛋白胨+蛋白胨（1:1）、蛋白胨+肉提取物（1:1）、蛋白胨+酵母提取物（1:1）、酵母提取物+肉提取物（1:1）、胰蛋白胨、蛋白胨、酵母提取物（Y.E）、肉提取物（M.E）、氯化铵、硝酸铵和磷酸铵）以0.5%（w/v）浓度加入生产培养基，考察其对角蛋白酶合成的影响。培养基补充选定氮源的不同浓度（0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6%，w/v），取上清液进行酶活测定。将不同金属离子（包括Cu²⁺、Co²⁺、Al³⁺、Mn²⁺、K⁺、Na⁺和Fe³⁺）以氯化物盐形式加入生产培养基，浓度为1 mM。将产生最大酶产量的金属离子以1.0、2.0、3.0、4.0、5.0和6.0 mM的不同浓度加入培养基。在不同温度（25°C、30°C、35°C、40°C、45°C和50°C）下考察角蛋白酶产量以研究温度对酶生产的影响。对于pH和转速优化，将不同pH值（6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5和10.0）的生产培养基在先前优化条件下接种细菌培养物，转速为120、130、140、150、160、170和180 rpm，测定角蛋白酶活性。
【数据】初始条件：37°C、pH 7.0、120 rpm；接种量梯度：1.0–5.0%（v/v）；碳源浓度梯度：0.1–0.7%（w/v）；氮源浓度：0.5%（w/v）；氮源浓度梯度：0.1–0.6%（w/v）；金属离子浓度：1 mM；金属离子浓度梯度：1.0–6.0 mM；温度梯度：25–50°C；pH梯度：6.0–10.0；转速梯度：120–180 rpm
##### 2.2.8.2 响应面法（RSM）
设计并利用RSM考察十个自变量（接种量、培养时间、角蛋白浓度、葡萄糖浓度、胰蛋白胨浓度、酵母提取物浓度、NaCl浓度、温度、pH和转速）及其对Bacillus vallismortis Gz4角蛋白酶产量的累积效应。使用Design Expert软件（版本13）的Plackett-Burman和中心复合设计（CCD）进行RSM。
【数据】软件：Design Expert version 13；设计方法：Plackett-Burman + CCD；变量数：10个
##### 2.2.8.2.1 Plackett-Burman设计
PBD中采用10个不同参数：接种量、培养时间、角蛋白浓度、葡萄糖浓度、胰蛋白胨浓度、Y.E.浓度、NaCl浓度、温度、pH和转速。实验设计使用Design Expert 13.0软件创建，提供16次实验。
【数据】变量数：10个；实验次数：16次；软件：Design Expert 13.0
研究结果
3.1 产角蛋白酶细菌分离株的分离、筛选和分子鉴定
共57株细菌分离株在脱脂牛奶琼脂（SMA）平板上筛选蛋白水解活性，选择21株产生最大透明圈的分离株进行复筛。在21株蛋白酶阳性分离株中，17株通过在角蛋白琼脂平板上形成透明圈被确认为角蛋白酶阳性。分离株Gz4表现出最大角蛋白酶活性，为3.64 ± 0.42 U/ml。分离株Gz4产生的水解圈如图1a所示。分离株Gz4在琼脂平板上被表征为需氧、不规则奶油白色菌落，边缘呈波状（图1b）。革兰氏染色显示紫色杆状，表明该菌为革兰氏阳性（图1c）。该分离株被鉴定为Bacillus vallismortis Gz4（NCBI登录号：PV436814）。序列分析显示与Bacillus vallismortis菌株DSM_11031 16S rRNA同源性为99.7%，使用MEGA 12构建系统发育树（图2）。
【数据】筛选菌株数：57株；初筛阳性：21株；复筛角蛋白酶阳性：17株；Gz4活性：3.64 ± 0.42 U/ml；16S rRNA同源性：99.7%；NCBI登录号：PV436814；建树软件：MEGA 12
3.2 Bacillus vallismortis Gz4的生长曲线
48 h龄接种物产生最高角蛋白酶活性（6.63 ± 0.167 U/ml），随接种龄增加酶活性下降（图3）。角蛋白酶产量在生长对数晚期达到峰值。
【数据】最佳接种龄：48 h；最高酶活：6.63 ± 0.167 U/ml；产量峰值：对数晚期
3.3 OVAT法优化Bacillus vallismortis Gz4胞外角蛋白酶生产
接种量为3%（v/v）时观察到最高活性（7.54 ± 0.02 U/ml）（图4a）。对于角蛋白酶生产，M2培养基最为适合，酶活性为8.03 ± 0.11 U/ml（图4b）。葡萄糖为最佳碳源，角蛋白酶活性为8.13 ± 0.03 U/ml（图4c），而0.2%（w/v）葡萄糖浓度显示最大活性为9.60 ± 0.31 U/ml（图4d）。最适氮源为胰蛋白胨和Y.E（1:1）（11.03 ± 0.49 U/ml，图4e），其中0.4%（w/v）胰蛋白胨（10.83 ± 0.02 U/ml，图4f）和0.3%（w/v）酵母提取物显示最高活性为11.30 ± 0.02 U/ml（图4g）。研究金属离子影响后发现，Na⁺提高角蛋白酶活性（13.62 ± 0.40 U/ml，表2），3 mM Na⁺产生最大酶活性即15.52 ± 0.10 U/ml（图5a）。在40°C温度下观察到最高角蛋白酶活性（16.15 ± 0.19 U/ml）（结果未显示）。酶活性在pH 9.0时最大（18.35 ± 0.48 U/ml）（图5b），在150 rpm时最大（19.14 ± 0.13 U/ml）。需要指出的是，向碱性pH偏移会导致角蛋白酶活性发生显著变化。
【数据】最佳接种量：3%（v/v），7.54 ± 0.02 U/ml；最佳培养基：M2，8.03 ± 0.11 U/ml；最佳碳源：葡萄糖，8.13 ± 0.03 U/ml；最佳葡萄糖浓度：0.2%（w/v），9.60 ± 0.31 U/ml；最佳氮源：胰蛋白胨+Y.E（1:1），11.03 ± 0.49 U/ml；最佳胰蛋白胨浓度：0.4%（w/v），10.83 ± 0.02 U/ml；最佳酵母提取物浓度：0.3%（w/v），11.30 ± 0.02 U/ml；最佳金属离子：Na⁺，13.62 ± 0.40 U/ml；最佳Na⁺浓度：3 mM，15.52 ± 0.10 U/ml；最佳温度：40°C，16.15 ± 0.19 U/ml；最佳pH：9.0，18.35 ± 0.48 U/ml；最佳转速：150 rpm，19.14 ± 0.13 U/ml
3.4 统计学方法（响应面法）
#### 3.4.1 PBD（Plackett-Burman设计）
使用PBD研究了十个因素（接种量、培养时间、角蛋白浓度、葡萄糖浓度、胰蛋白胨浓度、Y.E浓度、NaCl浓度、温度、pH和转速）对Bacillus vallismortis Gz4胞外角蛋白酶生产的影响。PBD生成的16次运行模型显示，不同运行的响应值在1.76至21.37 U/ml之间变化（表3）。分析PBD Pareto图（图6）后观察到四个参数——培养时间、Y.E浓度、pH和接种量——对角蛋白酶生产具有正效应。模型显著性的p值应为0.05或更低。10个参数的推荐运行见表3。校正R²与预测R²之间的差异小于0.2。p值小于0.0500表示模型项显著。在本例中无显著模型项。值大于0.1000表示模型项不显著。失拟F值为4.36，表明失拟相对于纯误差不显著（表4）。如此大的失拟F值因噪声而出现的概率为12.59%。
【数据】实验运行数：16次；响应值范围：1.76–21.37 U/ml；显著正效应因子：培养时间、Y.E浓度、pH、接种量；失拟F值：4.36；噪声概率：12.59%；校正R²与预测R²差异：<0.2
#### 3.4.2 CCD（中心复合设计）
基于PBD分析结果，四个关键因素——培养时间、酵母提取物（Y.E.）浓度、pH和接种量——被确定为显著影响角蛋白酶生产。随后使用中心复合设计（CCD）考察这些变量以确定其最优值并评估其对酶产量的联合效应。为分析变量，建立了30次运行的CCD模型（表5）。角蛋白酶活性在48 h培养、0.35%（w/v）Y.E浓度、pH 9.0和3%（v/v）接种量条件下最高（24.97 U/ml）。基于CCD结果的ANOVA分析，Design Expert模型识别出四个过程阶数。由于最优二次阶数被证明最为有效，进一步对其进行分析。二次模型ANOVA结果显著，极低的概率值[（P model > F）= 0.0001]和Fisher F检验中136.98的均方回归证实了这一点（表6）。模型拟合度用R²（决定系数）衡量。R²值为0.9981，模型有效解释了响应中99.81%的变异（表1，补充材料）。预测R²与校正R²的差异小于0.2。失拟检验不显著，支持二次模型的有效性（表7）。
【数据】CCD运行数：30次；最高酶活：24.97 U/ml；最优条件：48 h、0.35%（w/v）Y.E、pH 9.0、3%（v/v）接种量；P model > F：0.0001；均方回归：136.98；R²：0.9981（99.81%变异解释）；预测R²与校正R²差异：<0.2
#### 3.4.3 不同变量组合的响应面3-D图
3D响应面图（图7a–f）用于考察不同变量间的交互作用。当两个参数固定而改变另外两个参数的浓度时，利用回归分析生成3D响应模型。中心复合设计（CCD）为四个显著因素的不同组合生成了3-D响应图。pH和培养时间的交互作用在pH 9.0、48 h培养时间时给出最大活性，而0.35%（w/v）酵母提取物浓度产生最高活性。类似地，接种量和培养时间的组合在3%（v/v）和48 h培养时给出最大活性。pH和酵母提取物浓度的交互作用也在pH 9.0和0.35%（w/v）Y.E浓度时增加活性。接种量和酵母提取物浓度之间的响应图表明在3%（v/v）和0.35%（w/v）Y.E浓度时活性最大。这些结果证实了pH、培养时间、酵母提取物浓度和接种量在决定最适角蛋白酶活性中的联合效应。
【数据】pH+培养时间：pH 9.0、48 h；Y.E浓度：0.35%（w/v）；接种量+培养时间：3%（v/v）、48 h；接种量+Y.E：3%（v/v）、0.35%（w/v）
#### 3.4.4 扰动图和模型验证
扰动图（图8a）展示了不同参数对角蛋白酶活性的单独效应。在该图中，一个因素在范围内变化而其他因素保持中心值不变，允许直接比较各参数的影响。偏离参考点的程度表明角蛋白酶活性对相应因素的敏感性。该图还验证了优化过程的可靠性并识别出最显著的参数。
【数据】原文未详述具体数值，图形展示各参数单独效应及敏感性
3.5 粗酶提取物对Fusarium sp.和Mucor sp.的抗真菌活性
评估了粗酶提取物（酶活性24.32 ± 0.41 U/ml，蛋白含量1.82 mg/ml，比活性13.36 U/mg蛋白）对致病真菌Fusarium sp.和Mucor sp.的抗真菌活性，抑制圈分别如图9a和9b所示，其中+ve和-ve分别表示阳性对照（抗生素）和阴性对照（培养基）。该酶对Fusarium sp.在80 μl时表现出最大抗真菌效力，抑制圈为20.3 ± 0.07 mm；对Mucor sp.在100 μl时抑制圈为20.8 ± 0.23 mm，如表1（补充材料）所示。粗角蛋白酶作为生物杀菌剂的潜力通过其裂解Fusarium sp.和Mucor sp.细胞壁聚合物的能力得到证明。
【数据】粗酶酶活：24.32 ± 0.41 U/ml；蛋白含量：1.82 mg/ml；比活性：13.36 U/mg蛋白；Fusarium sp.：80 μl，抑制圈20.3 ± 0.07 mm；Mucor sp.：100 μl，抑制圈20.8 ± 0.23 mm
3.6 粗酶提取物的MIC
（原文此处截断，后续内容未提供）
【数据】原文未详述
讨论与解读
工业界对具有高效催化性能的新型角蛋白酶来源的需求，推动了研究者分离新的角蛋白酶合成菌株并优化其生产条件。从富角蛋白废弃物环境（如家禽养殖场和羽毛堆放场）成功分离产角蛋白酶细菌，凸显了这些微生物对降解顽固角蛋白底物的适应性进化。例如，Greeshma等（2025）从饲喂家禽废弃物的养殖场中分离到Pangasianodon hypophthalmus，表现出显著的角蛋白水解活性。类似地，Kumar等（2023）报道了从家禽养殖场土壤中分离到Bacillus mojavensis par01，具有可观的角蛋白酶产量。这些发现强调了产角蛋白酶细菌在富角蛋白栖息地中的普遍性，表明此类环境是具有强效角蛋白降解能力微生物的储库。芽孢杆菌属一直被确定为产角蛋白酶细菌中的优势类群，这归因于其强大的酶系统和在多样环境条件下生存的能力。不同研究中芽孢杆菌属的反复分离强调了其在角蛋白降解中的关键作用及其在涉及角蛋白废弃物管理的工业过程中的潜在应用价值。Bacillus vallismortis Gz4的生长……
编译者解读： 该研究采用OVAT与RSM两阶段优化策略，先以单因素法快速锁定关键变量，再用Plackett-Burman筛选显著因子、CCD精细调优，路径清晰高效。R²达0.9981表明模型可靠性高。粗酶液对两种病原真菌的抑制圈均超过20 mm，展示了"一酶双用"——角蛋白降解与生物防治的潜力。但研究仅停留在粗酶水平，未进行酶纯化与稳定性测试，离工业应用尚有距离。后续可关注重组表达与固定化方向。
参考来源
期刊：Biocatalysis and Agricultural Biotechnology, 2026
DOI: 10.1016/j.bcab.2026.104193
DOI: 10.1016/j.bcab.2026.104193