来源：Efflux pump gene ABCA as targets for deep learning-based de novo inhibitors in invasive aspergillosis caused by Aspergillus fumigatus（Computational Biology and Chemistry）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
侵袭性曲霉病（IA）死亡率高，烟曲霉外排泵AbcA介导的唑类耐药是临床治疗失败的关键原因之一。本研究以AbcA的ATP结合区为靶点，整合多重序列比对、Protein Generator、ProteinMPNN、C2Pred、AllerCatPro、DeepSTABp、OmegaFold、GRAMM分子对接及分子动力学模拟等计算与深度学习工具，从162条曲霉属AbcA序列出发，经保守区提取、从头结合剂生成、细胞穿膜肽修饰、致敏性与热稳定性筛选，最终从7200条候选序列中锁定abcA-2795等结合剂。该结合剂预测无致敏性、具细胞穿透潜力、熔点在81–83°C之间，并与AbcA的ATP结合域及跨膜域形成稳定相互作用，为克服真菌耐药提供了候选分子与计算设计范式。
研究背景
侵袭性曲霉病是一种严重且危及生命的真菌感染，主要累及免疫功能低下人群。吸入曲霉孢子后，感染可始于肺部并扩散至其他器官。烟曲霉是IA最常见的病原体，占侵袭性曲霉感染的多数。该真菌广泛存在于空气、土壤和腐烂有机物中，其产生的无性孢子（分生孢子）易随空气传播被人类吸入。血液系统恶性肿瘤患者、接受化疗者、移植受者以及HIV/AIDS患者均为高危人群。IA死亡率高，难治性病例死亡率可达50%至100%。感染的严重性源于烟曲霉菌丝可侵入肺小动脉，导致血行播散、血栓形成、出血性梗死以及肾脏、肝脏、脾脏、鼻窦和中枢神经系统等远端器官损伤。此外，流感或COVID-19患者合并IA的报道日益增多，可导致严重急性呼吸窘迫综合征、住院时间延长和死亡率升高。在此背景下，靶向烟曲霉耐药相关外排泵、恢复抗真菌药物有效性成为迫切需求。
研究方法
2.1 序列检索
从UniProt数据库（https://www.uniprot.org/）获取所有可用曲霉属菌株的abcA蛋白序列。为保证一致性，剔除长度短于全长abcA 70%的序列。选择烟曲霉的abcA序列（UniProt ID: Q4X006）作为后续分析的参考序列。
【数据】数据库：UniProt；参考序列：烟曲霉abcA（UniProt ID: Q4X006）；序列筛选阈值：长度≥全长70%；剔除标准：短于全长70%的序列
2.2 abcA已验证结合位点评估
从PROSITE数据库获取abcA蛋白结构中已报道的ATP结合位点，登录号为PRU00434，揭示C端第893–900位氨基酸“GVTGAGKT”。
【数据】数据库：PROSITE；登录号：PRU00434；ATP结合位点：C端第893–900位氨基酸；基序：GVTGAGKT
2.3 基于多重序列比对的保守区识别
为研究acbA在不同曲霉属物种和菌株中的进化趋势，使用Clustal Omega网络服务器（https://www.ebi.ac.uk/jdispatcher/msa/clustalo）以默认参数对acbA蛋白序列进行多重序列比对（MSA）。分析比对序列以识别保守模式。使用自定义Python脚本从MSA中提取最保守区域，特别聚焦于已知参与ATP结合的区域。随后，使用另一个自定义Python脚本基于这些保守区域生成每个曲霉属物种的共有序列。
【数据】工具：Clustal Omega；参数：默认参数；保守区提取：自定义Python脚本；共有序列生成：自定义Python脚本
2.4 结合剂的从头设计
使用来自曲霉属的保守共有abcA蛋白序列，通过Protein Generator（https://huggingface.co/spaces/merle/PROTEIN_GENERATOR）预测3D结构，该工具用于生成从头蛋白序列及其对应结构。将DDPM风格扩散模型应用于蛋白序列空间以生成序列-结构对。以RoseTTAFold为起点，对模型进行微调，使其能从部分加噪序列预测序列和结构，提高生成准确蛋白模型的能力。训练对预测序列和结构均施加损失，确保生成连贯的序列-结构对。序列空间中的扩散允许引入势能以引导过程朝向特定性质，如氨基酸组成和净电荷。此外，该模型能够从特定家族采样蛋白，或利用序列到功能分类器引导生成具有所需功能特征的序列。然后，将设计并预测的结构输入ProteinMPNN（https://huggingface.co/spaces/simonduerr/ProteinMPNN）工具，生成60条不同的从头蛋白序列，同时将先前识别的保守氨基酸保持为固定残基。其余位置被修改，使用vanilla-v-48–20模型，在采样温度0.3下每次运行生成15条序列。这些序列被设计为保留相似的结构构象，同时物理化学性质发生变化。
【数据】工具：Protein Generator、ProteinMPNN；模型：DDPM风格扩散模型、vanilla-v-48–20；生成序列数：60条；采样温度：0.3；每次运行生成：15条；固定残基：保守氨基酸
2.5 引入细胞穿膜肽以促进细胞穿透
为确保有效的细胞内递送，从CellPPD（http://crdd.osdd.net/raghava/cellppd/）检索具有已知细胞穿膜肽（CPP）特性的实验验证AMP基序。将验证过的CPP基序附加到先前生成的60条从头蛋白序列的N端和C端，对这些序列进行修饰。随后使用C2Pred网络服务器分析这些修饰序列，以预测CPP潜力和评估穿透效率。C2Pred采用基于序列的分析和优化的二肽组成来识别CPP，通过5折交叉验证达到83.6%的总体成功率，CPP正确识别率为81.5%，非CPP正确识别率为85.6%。基于此分析，选择预测为CPP概率最高的前100条从头序列进行进一步研究。
【数据】数据库：CellPPD；工具：C2Pred；修饰序列数：60条；CPP基序：120个已知CPP基序；附加位置：N端和C端；C2Pred总体成功率：83.6%；CPP识别率：81.5%；非CPP识别率：85.6%；筛选：前100条
2.6 过滤潜在致敏原
为评估从头生成序列的致敏性和潜在毒性，使用AllerCatPro（https://allercatpro.bii.a-star.edu.sg/）进行蛋白致敏性预测。AllerCatPro结合蛋白过敏原的结构、序列和表位特征来识别潜在致敏风险。更新后的AllerCatPro 2.0利用来自主要数据库的大量致敏蛋白序列数据集，其中许多包含专家人工审编。被标记为具有“强证据”致敏性的序列被排除在进一步分析之外，以确保安全性并最小化不良反应风险。
【数据】工具：AllerCatPro 2.0；排除标准：致敏性“强证据”；数据来源：主要数据库致敏蛋白序列（含专家人工审编）
2.7 从头结合剂热稳定性评估
蛋白热稳定性对于理解功能、设计治疗药物以及增强工业应用中的酶稳定性至关重要。为评估从头结合剂的这一参数，使用DeepSTABp（https://csb-deepstabp.bio.rptu.de/）进行热稳定性预测，生长温度设为60°C，“cell”环境。DeepSTABp利用基于transformer的蛋白语言模型进行序列嵌入和特征提取，借助深度学习技术预测熔解温度。该方法识别影响蛋白稳定性和热鲁棒性的结构特征。热稳定性对于AMP在温度波动中保持功能构象至关重要，确保与微生物膜的有效相互作用。此外，热稳定的AMP具有改善的储存和保质期特性，使其更适合治疗使用而无需冷藏。基于预测结果，选择前10个热稳定结构进行进一步分析。
【数据】工具：DeepSTABp；生长温度：60°C；环境：“cell”；预测指标：熔解温度；筛选：前10个热稳定结构
2.8 从头结合剂3D结构预测
使用OmegaFold预测入围从头序列的3D结构，OmegaFold是一种深度学习框架，可在不依赖MSA的情况下预测给定蛋白序列的3D结构。为优化预测结构，通过OpenMM（https://openmm.org/）使用CHARMM力场进行100步能量最小化，OpenMM是用于分子动力学模拟和蛋白模型优化的工具包。该过程确保为后续分析生成稳定且能量有利的蛋白结构。
【数据】工具：OmegaFold、OpenMM；力场：CHARMM；能量最小化步数：100步；依赖MSA：否
2.9 abcA与设计抑制剂之间的蛋白-蛋白分子对接
将烟曲霉abcA蛋白的3D结构（ID: AF-Q4X006-F1）与上一步生成的前10个入围从头模型进行对接。使用GRAMM（Global Range Molecular Matching）算法（https://gramm.compbio.ku.edu/）进行蛋白-蛋白分子对接，以ATP结合位点作为目标区域。GRAMM系统探索分子间能量景观，预测对应稳定相互作用（深能量极小值）和瞬时相互作用（浅极小值）的多种对接姿态。选择排名前三的对接复合物进行进一步分析。使用PDBSum工具（https://www.ebi.ac.uk/thornton-srv/databases/pdbsum/）基于能量谱评估所得对接构象的潜在蛋白-蛋白相互作用。该工具提供关键相互作用特征的详细可视化，包括对接蛋白之间的氢键、盐桥和疏水接触。蛋白结构域的额外信息从InterPro数据库（https://www.ebi.ac.uk/interpro）获取。
【数据】工具：GRAMM、PDBSum、InterPro；abcA结构ID：AF-Q4X006-F1；对接模型数：前10个；目标区域：ATP结合位点；选择：排名前三的对接复合物
2.10 分子动力学模拟
使用Maestro进行分子动力学模拟，以评估abcA-结合剂复合物的稳定性。模拟结果表明abcA-2795复合物表现出最稳定的构象。
【数据】工具：Maestro；模拟对象：abcA-结合剂复合物；最稳定复合物：abcA-2795
研究结果
3.1 曲霉属abcA中保守ATP结合区的识别
共获得162条来自曲霉属的abcA蛋白序列（平均长度1493个氨基酸）。MSA分析显示，abcA蛋白最保守的区域跨越第865–925位残基，该区域也覆盖了第893–900位氨基酸的ATP结合位点区域，如图1A所示。基于这段60个残基的保守区域，生成了共有序列：“XXXFXXFXXXXYXXXXEXXXXXXSKGEXLXFXRGXXXXXXXXXXXXXEEXXEXXXXXXXXX”，其中X代表任何可能的氨基酸，展示了曲霉属在这些位点的多样性。随后使用该共有序列设计从头蛋白序列和结构，固定未标记为“X”的残基位置。使用Protein Generator预测从头序列和结构，在20步扩散后显示pLDDT评分为0.9。该高pLDDT评分表明蛋白结构高度可靠和准确，如图1B所示。
【数据】abcA序列数：162条；平均长度：1493个氨基酸；最保守区域：第865–925位残基；ATP结合位点：第893–900位氨基酸；共有序列长度：60个残基；pLDDT评分：0.9；扩散步数：20步
3.2 热稳定非致敏从头结合剂的生成
使用深度学习框架ProteinMPNN，基于先前获得的从头结构共生成60个不同的从头结合剂。这些结合剂保留相似的结构构象，同时在其物理化学性质上表现出变异。为在这些从头生成序列中诱导细胞穿透能力，将来自CellPPD的120个已知CPP基序附加到序列的C端和N端，共生成7200条长度各异的从头序列。为预测其CPP潜力，采用C2Pred，在7200条从头序列中识别出2346条具有穿透细胞潜力的序列，概率评分如图1C所示。序列见补充文件1。基于此评估，预测可穿透细胞的前100条肽被入围进一步分析。此外，为预测从头序列的致敏性，采用AllerCatPro，没有序列被预测具有“强”甚至“弱”致敏性证据，表明生成的结合剂高度非致敏。接下来，为评估这些入围从头序列用于潜在治疗的热稳定性，使用DeepSTABp。分析显示这些序列的熔解温度各异，范围从48°C到83°C。因此，选择前10条熔解温度均在81°C至83°C之间的从头序列进行进一步分析，如图1D所示。
【数据】从头结合剂数：60个；CPP基序数：120个；附加位置：C端和N端；总从头序列数：7200条；C2Pred识别CPP潜力序列：2346条；入围前100条；致敏性预测：无“强”或“弱”证据；熔解温度范围：48°C–83°C；前10条熔解温度：81°C–83°C
3.3 从头结构与abcA的分子对接
10条入围的从头序列被鉴定为潜在CPP，熔解温度在81至83°C之间，进一步使用OmegaFold进行3D结构预测。所得结构展示于图1E-N，叠加的从头结构展示于图2B。此外，烟曲霉abcA蛋白的3D结构从AlphaFold数据库获取，编号AF-Q4X006-F1，用于分子对接，如图2A所示。值得注意的是，abcA蛋白包含多个关键结构域，包括PDR亚家族G，由第二个结构域（cd03232, IPR034003）跨越第855–1082位氨基酸和第一个结构域（cd03233, IPR034001）从第173–397位残基组成。该蛋白还具有ABC-2型转运蛋白跨膜结构域（IPR013525），覆盖第508–717位和第1175–1390位氨基酸。它被分类为多个同源超家族，如含P-loop的核苷三磷酸水解酶（G3DSA:3.40.50.300, IPR027417），覆盖区域173–407和861–1095。ABC转运蛋白样ATP结合结构域（IPR003439）存在于第166–415位和第857–1100位残基之间，而多效药物耐药蛋白PDR/CDR（IPR005285）位于第106至1490位。额外的保守位点（IPR017871）发现于第314–328位氨基酸之间，特定基序如ABC-2型转运蛋白（PF01061）发现于第508–717位残基之间，而CDR ABC转运蛋白（PF06422）位于第728至817位。功能注释包括基因本体（GO）术语，如ATP结合（GO:0005524）和药物耐药（GO:0042626），反映了其在多种分子跨细胞膜转运中的作用。入围化合物的结合能分析表明与靶蛋白的相互作用强度各异。在分析的复合物中，abcA_200表现出最有利的GRAMM对接评分（-623），表明根据GRAMM评分函数具有更有利的预测对接姿态，紧随其后的是abcA_2795为-612。第三强结合剂为abcA_620，GRAMM评分为-594，表明类似的强相互作用。相比之下，其他结合剂如abcA_92（-549）、abcA_1151（-534）和abcA_1172（-535）显示出相对较弱的结合能。因此，基于较强结合能选择用于进一步相互作用分析的前三个结合剂为abcA_200、abcA_2795和abcA_620。AbcA-从头结合剂对接结果见表1。这些复合物的PDBSum相互作用分析揭示了多个氢键和非键接触。对于abcA-200，共观察到9个氢键、580个非氢键和3个盐桥。链A（abcA蛋白）与链C（从头蛋白）之间的相互作用涉及氢键和盐桥，主要定位于abcA的关键功能域附近。氢键与ATP结合和跨膜域相关的残基形成，如GLY 297、ARG 305和LEU 520，这些对abcA作为ATP结合盒（ABC）转运蛋白的功能至关重要。这些相互作用可能稳定核苷酸结合域（如AAA+ ATP酶和ABC转运蛋白样结构域），并影响ATP水解或底物转运。盐桥，如涉及HIS 300和GLU 117的盐桥，进一步在关键功能位点加强这些相互作用。接触区域表明从头抑制剂在功能热点与abcA相互作用，可能调节其转运或ATP酶活性。此外，在第894至899位残基之间观察到若干非氢键相互作用，这些残基也位于本研究中识别的ATP结合区域内。从生物学角度，这意味着从头蛋白可能作为调节剂或效应器，改变abcA的构象和活性，这可能对底物特异性或abcA促进的多药耐药途径等过程产生影响。对于abcA-620，链A（abcA蛋白）与链C（从头蛋白）之间的相互作用以8个氢键、5个盐桥和570个非键接触为特征，表明界面稳固。氢键涉及链A的残基如Thr 304、Ser 315、Asp 1023和His 1056，与ATP结合盒和跨膜区等功能域一致。这些与从头抑制剂中的残基相互作用，包括Lys 87、Lys 109和Arg 118，表明稳定相互作用的特定接触点。盐桥进一步增强了这种稳定性，abcA蛋白中的Arg 305和Lys 121等残基与从头抑制剂中的Glu 106和Glu 117形成离子相互作用。广泛的非键接触也位于ATP结合区域（893–900）内，可能增强两个蛋白的整体GRAMM评分和结构兼容性。从生物学角度，这些相互作用可能表明功能耦合，其中abcA蛋白促进从头蛋白的活性或稳定性，可能涉及底物转运或信号转导过程，如从InterPro注释推断。对于abcA-2795，链A（abcA蛋白）与链C（从头蛋白）之间的相互作用……
【数据】OmegaFold预测结构数：10个；abcA结构ID：AF-Q4X006-F1；PDR亚家族G第二结构域：cd03232, IPR034003，第855–1082位；第一结构域：cd03233, IPR034001，第173–397位；ABC-2型转运蛋白跨膜域：IPR013525，第508–717位和第1175–1390位；P-loop核苷三磷酸水解酶：G3DSA:3.40.50.300, IPR027417，第173–407位和861–1095位；ABC转运蛋白样ATP结合域：IPR003439，第166–415位和第857–1100位；PDR/CDR：IPR005285，第106–1490位；保守位点：IPR017871，第314–328位；ABC-2型转运蛋白基序：PF01061，第508–717位；CDR ABC转运蛋白：PF06422，第728–817位；GO术语：ATP结合（GO:0005524）、药物耐药（GO:0042626）；GRAMM评分：abcA_200=-623，abcA_2795=-612，abcA_620=-594，abcA_92=-549，abcA_1151=-534，abcA_1172=-535；abcA-200相互作用：9个氢键、580个非氢键、3个盐桥；abcA-200氢键残基：GLY 297、ARG 305、LEU 520；abcA-200盐桥残基：HIS 300、GLU 117；abcA-200非氢键相互作用区域：第894–899位；abcA-620相互作用：8个氢键、5个盐桥、570个非键接触；abcA-620氢键残基：Thr 304、Ser 315、Asp 1023、His 1056；abcA-620盐桥残基：Arg 305、Lys 121、Glu 106、Glu 117；abcA-620非键接触区域：第893–900位
讨论与解读
本研究识别并分析了162个曲霉属物种中abcA蛋白的保守ATP结合区，并采用多种计算技术设计和评估潜在的从头结合剂以抑制其功能。MSA分析揭示abcA蛋白高度保守的ATP结合区跨越第865–925位残基，其中第893至900位的特别保守亚区对应ATP结合基序。该ATP结合域对ABC转运蛋白功能至关重要，因为它介导ATP水解以驱动包括抗真菌药物在内的多种底物的主动转运。鉴于该域在耐药中的核心作用，设计用于破坏该相互作用的肽有望成为真菌多药耐药的潜在抑制剂。这些发现与探索抑制ABC转运蛋白策略的研究一致，ABC转运蛋白在临床环境中的药物-药物相互作用和真菌多药耐药中发挥关键作用。研究表明，抗真菌药物如伊曲康唑等……
分子动力学模拟进一步显示，abcA-2795复合物在模拟期间表现出最稳定的构象。综合而言，abcA-2795兼具非致敏性、细胞穿透潜力和高热稳定性（熔点81–83°C），且其结合位点覆盖AbcA的ATP结合域与跨膜域，提示其可能通过干扰ATP结合或转运功能削弱外排泵活性。后续仍需实验验证这些结合剂的有效性与安全性。
编译者解读：该研究展示了“保守区提取—从头生成—多级过滤—对接与动力学验证”的完整计算管线，将深度学习蛋白设计用于真菌耐药靶点，方法整合度高。其亮点在于把CPP修饰与热稳定性筛选前置，提升了候选分子的成药性想象空间。但全部结论均基于预测工具，缺乏体外ATP酶抑制、外排功能及体内药效数据；结合剂是否为真实抑制剂而非单纯结合物，仍需湿实验证实。对合成生物学而言，该管线可迁移至其他耐药泵靶点，但需警惕预测工具间的误差累积。
参考来源
期刊：Computational Biology and Chemistry, 2027
DOI: 10.1016/j.compbiolchem.2026.109410
DOI: 10.1016/j.compbiolchem.2026.109410