来源：An electrochemical biosensor based on bioengineered cells and four-channel electrode device for pathogenic bacteria detection（Sensors and Actuators B: Chemical）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
食源性致病菌检测长期依赖物种特异性靶标，难以实现广谱识别。本研究将预制成型即用型NaAlg@纸基支架与集成培养腔的四通道电极装置结合，在HEK293细胞中表达hNAIP–NLRC4复合物构建工程化传感细胞，以高度保守的III型分泌系统（T3SS）为识别靶标。传感器对鼠伤寒沙门氏菌的线性范围为2.8 × 10²至2.8 × 10⁷ CFU/mL，检出限为1.7 × 10² CFU/mL，并可区分致病性与非致病性大肠杆菌。
研究背景
食源性致病菌检测是食品安全监测的重要环节。依赖独特基因或表面抗原的物种特异性方法，正日益受到致病菌快速适应性突变的制约。全基因组测序、宏基因组学和非靶向质谱指纹图谱等非靶向策略无需预先知道靶标即可全面刻画微生物群落及其致病潜力，但受限于专业门槛高和参考数据库不完整，难以广泛应用。
靶向广谱致病菌共有的保守毒力机制是更稳健的替代方案，可扩大覆盖范围并直接评估致病潜力。III型分泌系统（T3SS）是许多革兰氏阴性菌毒力所必需的保守针状纳米机器，是理想的广谱检测靶标。以活哺乳动物细胞作为生物识别元件的传感器可追溯至CANARY系统——利用表达钙敏感荧光素酶的B细胞通过免疫信号检测病原体。此后细胞传感器拓展至多种细胞类型和检测策略，但天然免疫细胞复杂的受体谱带来干扰。本研究以工程化HEK293/hNAIP–NLRC4细胞为传感元件，结合即用型纸基支架与四通道电极装置，构建面向保守毒力因子的广谱致病菌电化学生物传感器。
研究方法
2.1 材料
PrimeSTAR HS DNA聚合酶、T4 DNA连接酶、MiniBEST琼脂糖凝胶DNA提取试剂盒Ver.4.0、Premix Taq Version 2.0 plus dye购自TaKaRa Biotechnology Co., Ltd.（中国大连）。质粒和慢病毒包装试剂盒购自OBiO Technology Corp., Ltd.（中国上海）。质粒提取试剂盒购自Tiangen Biotech Co., Ltd.（中国北京）。AxyPrep质粒小提试剂盒由Axygen Biosciences（美国加州Union City）提供。异丙基-β-D-硫代半乳糖苷、polybrene和聚乙二醇二胺（PEG-diamine）由Sigma–Aldrich（美国密苏里州圣路易斯）提供。抗GSDMD抗体和抗pro Caspase−1 + p10 + p12抗体由Abcam（英国剑桥）提供。E. coli BL21细胞、Western及免疫沉淀用细胞裂解液、苯甲基磺酰氟、增强化学发光底物、胰蛋白酶–乙二胺四乙酸溶液、geneticin、hygromycin B和乳酸脱氢酶（LDH）细胞毒性检测试剂盒购自Beyotime Biotechnology（中国上海）。Pierce BCA蛋白检测试剂盒、PageRuler预染蛋白梯和SYTO 9绿色荧光核酸染料购自Thermo Fisher Scientific Inc（美国马萨诸塞州Waltham）。Puromycin由Amresco（美国俄亥俄州Solon）提供。Blasticidin由Yeasen Biotechnology（中国上海）提供。Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）、磷酸盐缓冲液（PBS）和Hank平衡盐溶液（HBSS）购自Servicebio Biotechnology（中国武汉）。胎牛血清（FBS）购自BioChannel Biotechnology（中国南京）。滤纸购自Whatman（英国Maidstone）。N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）、N-(3-二甲氨基丙基)-N′-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC）、NaAlg、聚乙二醇双(胺)、铁氰化钾和三水合亚铁氰化钾购自Aladdin（中国上海）。HEK293细胞购自中国科学院干细胞库（中国上海）。HEK293和HEK293/hNAIP–NLRC4细胞的培养基为含10% FBS的DMEM。细胞在37°C、5% CO2条件下培养。鼠伤寒沙门氏菌（S. typhimurium）ATCC 14028、肠出血性大肠杆菌（EHEC）O157:H7 ATCC 35150、福氏志贺菌CMCC(B) 51572、单核细胞增生李斯特菌ATCC 19115、金黄色葡萄球菌ATCC 25923、E. coli K12 ATCC 47076，以及携带pR995-SPI1质粒（含编码沙门氏菌T3SS的完整SPI−1致病岛，以下称E. coli K12-SPI1）的E. coli K12，均由南京市食品药品监督检验院（中国南京）提供。
【数据】培养基：DMEM含10% FBS；CO2浓度：5%；温度：37°C；菌株：S. typhimurium ATCC 14028、EHEC O157:H7 ATCC 35150、S. flexneri CMCC(B) 51572、L. monocytogenes ATCC 19115、S. aureus ATCC 25923、E. coli K12 ATCC 47076、E. coli K12-SPI1；其余参数原文未详述
2.2 预制成型即用型NaAlg@纸基支架与四通道电极装置的制备
#### 2.2.1 预制成型即用型NaAlg@纸基支架
通过在纸芯片中心设计四个直径11 mm的亲水区域实现独立且互不干扰的细胞培养，其余区域通过蜡打印变为疏水。将固体蜡块装入蜡打印机加热储库，在精确温控下（通常120°C–140°C）熔化为液态蜡。熔融蜡通过打印头的微米级喷嘴经压电或热气泡驱动喷出，按需在Whatman No. 2滤纸上形成微滴沉积。液蜡接触纸面后在室温下数毫秒内迅速冷却固化，牢固粘附于纸面。随后向亲水区域加载0.1 mL 2%（w/v）NaAlg溶液。接着加入溶于无水乙醇–水（4:1，v/v）的50 mM EDC与10 mM NHS混合物，用量为0.1 mL/cm²材料。然后施加同体积的15%（w/v）PEG-diamine溶液。最后将纸芯片在–80°C冷冻过夜，并在–60°C、1 × 10⁻⁴ kPa条件下冻干24 h，得到预制成型即用型NaAlg@纸基支架，如图S1所示。
【数据】亲水区域直径：11 mm；蜡熔化温度：120°C–140°C；NaAlg浓度：2%（w/v），体积：0.1 mL；EDC浓度：50 mM；NHS浓度：10 mM；乙醇–水比例：4:1（v/v）；EDC/NHS用量：0.1 mL/cm²；PEG-diamine浓度：15%（w/v）；冷冻温度：–80°C；冻干温度：–60°C；冻干压力：1 × 10⁻⁴ kPa；冻干时间：24 h
#### 2.2.2 四通道电极装置
四通道电极装置的制备分两部分。第一部分为上下板的制备。该部分使用软件设计并由计算机数控（CNC）雕刻机（苏州铭雕数控科技有限公司）加工。两块板均由亚克力制成。如图1A所示，底板尺寸为124 × 111 × 8 mm³，中央有96 × 39 × 2 mm³的凹槽以容纳并固定B270玻璃板。顶板尺寸为116 × 36 × 8 mm³，含四个直径9.4 mm的圆形中空结构，间距11.3 mm。顶板与底板通过螺丝组装固定。第二部分为四通道金电极的制备。电极通过金属化工艺沉积在96 × 39 × 2 mm³的B270玻璃板上。每个通道包含工作电极、参比电极和对电极，如图1B所示。
【数据】底板尺寸：124 × 111 × 8 mm³；底板中央凹槽：96 × 39 × 2 mm³；顶板尺寸：116 × 36 × 8 mm³；中空结构直径：9.4 mm；间距：11.3 mm；玻璃板尺寸：96 × 39 × 2 mm³；材料：亚克力、B270玻璃
2.3 稳定表达hNAIP和NLRC4细胞的制备
#### 2.3.1 质粒构建
人NAIP、NLRC4、pro-caspase-1和GSDMD的全长基因（GenBank登录号分别为NM_001346870.1、NM_001199139.1、NM_001257118.3和NM_024736.7）经商业合成，两端带EcoRI和XbaI位点。各片段插入慢病毒载体，生成pSLenti-CMV-NAIP-3×FLAG-PGK-Puro-WPRE、pcSLenti-EF1-BSR-CMV-NLRC4-HA-WPRE、pCLenti-EF1-Neo-CMV-pro-Caspase1-WPRE和pLenti-EF1-EGFP-F2A-Hygro-CMV-GSDMD-WPRE。所有构建体均经DNA测序验证。
【数据】基因：NAIP、NLRC4、pro-caspase-1、GSDMD；GenBank登录号：NM_001346870.1、NM_001199139.1、NM_001257118.3、NM_024736.7；限制性位点：EcoRI、XbaI；其余参数原文未详述
#### 2.3.2 HEK293细胞的感染
接种HEK293细胞，用脂质体转染试剂将重组慢病毒质粒与包装试剂共转染。过夜孵育后，48 h收集上清，离心、过滤并超速离心浓缩。病毒沉淀重悬于PBS。在polybrene存在下用慢病毒转导HEK293细胞，转导后72 h施加抗生素筛选。筛选两周后建立共表达目标蛋白的稳定细胞系。用特异性抗体经Western blotting验证蛋白表达。
【数据】上清收集时间：转染后48 h；抗生素筛选时间：转导后72 h；筛选周期：2周；其余参数原文未详述
2.4 传感器构建
将即用型纸芯片置于四通道电极装置亚克力下板的金电极上，确保四个亲水区域与对应电极对齐。然后将亚克力上板置于纸芯片上方，其四个中空结构与亲水区域对齐。用螺丝固定上下板。电化学测量时，通过中空结构向每个亲水区域加入100 μL细胞悬液。连接四通道电化学分析仪（PalmSens MultiPalmSens4，中国），得到最终基于CiGiP的电化学生物传感器。
【数据】细胞悬液体积：100 μL/通道；仪器：PalmSens MultiPalmSens4四通道电化学分析仪；其余参数原文未详述
2.5 传感器表征
向即用型纸芯片亲水区域加入由铁氰化钾和三水合亚铁氰化钾配制的2.5 mM Fe(CN)₆³⁻/⁴⁻溶液。采用循环伏安法（CV）、差分脉冲伏安法（DPV）和电化学阻抗谱（EIS）表征传感器。CV测试条件：初始电位–0.7 V；终止电位+0.5 V；扫描速率100 mV/s；采样间隔10 mV。DPV测试条件：初始电位–0.7 V；终止电位+0.4 V；电位增量10 mV；脉冲宽度10 ms；脉冲周期500 ms。EIS测试条件：最低频率0.3 Hz；最高频率10⁵ Hz；频率数61，相当于约10.9点/十倍频程的对数分布密度。
【数据】Fe(CN)₆³⁻/⁴⁻浓度：2.5 mM；CV初始电位：–0.7 V；CV终止电位：+0.5 V；CV扫描速率：100 mV/s；CV采样间隔：10 mV；DPV初始电位：–0.7 V；DPV终止电位：+0.4 V；DPV电位增量：10 mV；DPV脉冲宽度：10 ms；DPV脉冲周期：500 ms；EIS最低频率：0.3 Hz；EIS最高频率：10⁵ Hz；EIS频率数：61
2.6 电化学检测（原文节选，后续步骤未详述）
原文此处节选截断，后续实验步骤未详述。
【数据】原文未详述
研究结果
3.1 传感器的制备与工作原理
基于工程化细胞和四通道电极装置的致病菌检测电化学生物传感器的制备与工作原理如Scheme 1所示。将Whatman No. 2滤纸切成矩形条（90 × 25 mm²）。纸条通过蜡打印图案化出四个亲水区域。亲水区域制备为预制成型即用型NaAlg@纸基支架（图S1），置于四通道电极装置的上下板之间，每个亲水区域与对应电极对齐。组件用螺丝固定。向每个亲水区域分别加入细胞悬液进行细胞固定，随后用不同浓度的S. typhimurium刺激细胞。装置连接四通道电化学工作站进行电化学分析。当携带功能性T3SS（分泌系统组装且针蛋白暴露）的致病菌接触HEK293/hNAIP–NLRC4细胞时，胞内hNAIP受体识别T3SS针蛋白，诱导hNAIP构象变化并迅速招募激活NLRC4形成炎症小体。炎症小体组装激活caspase−1，释放包括IL-1β和IL-18在内的炎性细胞因子，触发细胞焦亡。焦亡导致胞内成分释放，增加电极表面附近电导率并产生可检测的电化学信号。
【数据】滤纸尺寸：90 × 25 mm²；亲水区域数：4；刺激物：S. typhimurium；其余参数原文未详述
3.2 四通道电极装置的成功制备
四通道电极装置由上下板和四个金电极组成。如图1C所示，下板包括一组弹簧安装的针式固定件，由两个丙烯腈-丁二烯-苯乙烯热塑性组件、一个带四腔的FR−4树脂件和四组针组成。上板配备四个中空结构和密封圈。四个金电极制备在B270玻璃基底上。电极置于下板中央凹槽，上板置于其上。纸芯片插入金电极与上板之间，用螺丝固定，得到适用于细胞测试的四通道电极装置（图1D）。该装置允许在四个通道同时进行CV、DPV和EIS测量而无交叉干扰（图S2）。
【数据】通道数：4；组件：2个ABS热塑性组件、1个FR−4树脂件（四腔）、4组针；其余参数原文未详述
3.3 工程化细胞的成功构建
Western blot分析确认工程化HEK293/hNAIP–NLRC4细胞中hNAIP（抗Flag，约154 kDa）、NLRC4（抗HA，约116 kDa）、pro-caspase-1（抗His，约45 kDa）和GSDMD（抗GSDMD，约53 kDa）稳定过表达，而亲本HEK293细胞或空载体对照中未检测到相应条带（图S9）。结果表明重组基因成功基因组整合并稳定表达。用T3SS阳性S. typhimurium刺激后，工程化细胞表现出显著的焦亡性膜损伤（经LDH测定，图S4），证实通路功能性重建。
【数据】hNAIP分子量：约154 kDa；NLRC4：约116 kDa；pro-caspase-1：约45 kDa；GSDMD：约53 kDa；其余参数原文未详述
3.4 电化学行为的表征
在2.5 mM Fe(CN)₆³⁻/⁴⁻中用CV、DPV和EIS表征电极电化学行为。如图2A和2B曲线a所示，裸金电极上观察到一对可逆氧化还原峰，峰电流756.4 µA。裸纸/金电极峰电流略降至727.3 µA（图2B曲线b）。即用型纸芯片/金电极进一步降至670.0 µA（图2B曲线c）。当1 × 10⁴ cells/mL细胞固定在即用型纸芯片上时，峰电流进一步降至641.5 µA（图2B曲线d）。这一降低可归因于细胞和水凝胶的绝缘特性影响电极表面电子传递。EIS也表征了传感器的逐层组装。通过拟合Nyquist图获得电阻（R et）值。裸金电极R et值为48.7 Ω（图2C曲线a）。裸纸置于电极上后，Nyquist图半圆增大，R et值增至57.5 Ω（图2C曲线b）。组装含NaAlg的即用型纸芯片后，R et值增至97.6 Ω（图2C曲线c）。细胞固定到即用型纸芯片后，R et值进一步增至177.8 Ω（图2C曲线d）。EIS变化与CV和DPV相反，证实细胞电化学传感器成功构建。随后用EIS优化传感器所需细胞浓度。如图2D所示，电阻随细胞浓度增加逐渐增大后趋于平台。在1 × 10² cells/mL至1 × 10⁶ cells/mL范围内，细胞浓度对数与电阻呈良好线性相关。线性方程为y = 15.72lgx + 113.1（x为细胞浓度），R² = 0.9794。细胞浓度大于1 × 10⁶ cells/mL时线性关系不再成立。因此选择1 × 10⁶ cells/mL为传感器最佳细胞浓度。
【数据】Fe(CN)₆³⁻/⁴⁻浓度：2.5 mM；裸金电极峰电流：756.4 µA；裸纸/金电极：727.3 µA；即用型纸芯片/金电极：670.0 µA；固定细胞后：641.5 µA；细胞浓度：1 × 10⁴ cells/mL；裸金电极R et：48.7 Ω；裸纸/金电极：57.5 Ω；即用型纸芯片/金电极：97.6 Ω；固定细胞后：177.8 Ω；线性范围：1 × 10²–1 × 10⁶ cells/mL；线性方程：y = 15.72lgx + 113.1；R² = 0.9794；最佳细胞浓度：1 × 10⁶ cells/mL
3.5 S. typhimurium的电化学检测
选择功能性T3SS阳性S. typhimurium作为模型致病菌。首先基于对S. typhimurium的DPV响应优化孵育时间。如图S5所示，高浓度组在前2 h内ΔI快速增加，之后信号趋于平台仅微小变化。相反，低浓度组在0–4 h期间ΔI持续增加。这一差异可归因于两种细菌浓度下NAIP配体胞内积累速率不同。高浓度时T3SS配体快速分泌，促进高效炎症小体组装及后续焦亡；而低细菌密度时焦亡响应显著延迟。需注意，长时间高浓度S. typhimurium刺激可对HEK293细胞产生非特异性细胞毒性，可能干扰基于NAIP-NLRC4的检测。综合考虑检测时长、信号区分度和延长孵育时间的非特异性细胞毒性风险，选择2 h用于后续所有实验。如图3A所示，DPV峰电流随细菌浓度增加而增大。这一增加归因于S. typhimurium刺激HEK293/hNAIP–NLRC4细胞激活hNAIP–NLRC4–caspase−1通路，触发包括IL-1β和IL-18在内的促炎细胞因子释放并诱导焦亡。随之细胞破裂释放胞内成分，增强电极及周围介质的电导率，最终导致电流增加。质膜结构损伤也导致LDH等胞内酶释放。据此测定LDH活性以量化S. typhimurium对HEK293/hNAIP–NLRC4细胞的细胞毒性效应。如图S4所示，细胞死亡率随细菌浓度增加，与电化学检测数据一致。这些结果共同表明，采用表达hNAIP细胞的基于CiGiP的电化学生物传感器可有效检测S. typhimurium。该传感器进一步……（原文此处节选截断）
【数据】孵育时间优化：高浓度组2 h达平台，低浓度组0–4 h持续增加；选定孵育时间：2 h；检测模型菌：S. typhimurium；其余参数原文未详述
3.6 传感器对S. typhimurium的检测性能（原文节选，数据见摘要）
原文此处节选截断，具体线性范围和检出限数据见摘要：线性范围2.8 × 10²至2.8 × 10⁷ CFU/mL，检出限1.7 × 10² CFU/mL。
【数据】线性范围：2.8 × 10²–2.8 × 10⁷ CFU/mL；检出限：1.7 × 10² CFU/mL；其余参数原文未详述
讨论与解读
本研究成功开发了一种新型细胞基电化学生物传感器，通过将工程化HEK293/hNAIP–NLRC4细胞与即用型NaAlg@纸芯片集成于四通道电极装置，实现基于保守毒力因子的广谱致病菌识别。该研究提升了识别未知菌株相关风险的能力，对推动食品安全管理从"被动反应"向"主动预防"范式转变具有重要价值。传感器具备环境稳定的长期可储存即用型3D细胞培养支架、无需笨重仪器的便携式电化学操作，以及单次运行同时检测多个样品、重复或对照的现场并行处理能力，较单通道设计有实质性升级。这些特性共同构成该小型化四通道设计在即时检测场景中的核心竞争力。展望未来，该平台可通过采用特异性细胞识别元件灵活适配多种分析物检测；整合微流控技术可提升自动化与通量；引入人工智能可实现复杂电化学信号的深度分析。
编译者解读：该研究的巧妙之处在于将合成生物学"重编程细胞作为传感器"的理念与低成本纸基电化学硬件结合。选择T3SS这一保守毒力因子而非物种特异抗原作为靶标，从原理上绕开了致病菌快速突变导致的检测脱靶问题。四通道设计兼顾了平行对照与重复需求，NaAlg@纸基支架的冻干即用特性则解决了细胞传感器长期储存的痛点。不过，当前工作仍局限于单一模型菌的验证，对复杂食品基质中多菌共存场景的广谱识别能力尚待检验；工程化细胞对低浓度T3SS配体的响应延迟也提示检测灵敏度仍有提升空间。将微流控与AI信号解析纳入下一代设计，是通往实用化的合理路径。
参考来源
期刊：Sensors and Actuators B: Chemical, 2026
DOI: 10.1016/j.snb.2026.140548
DOI: 10.1016/j.snb.2026.140548