来源：Specific, label-free and real-time sensing of glial fibrillary acidic protein (GFAP) in 0.5 μL drop of whole blood with a field-effect biosensor（Chemical Engineering Journal）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
脑损伤的快速诊断一直是临床痛点。胶质纤维酸性蛋白（GFAP）作为脑病理标志物，其检测通常依赖实验室大型设备。本研究利用Meta-Nano-Channel（MNC）场效应生物传感器，在0.5 μL未处理全血中直接实现GFAP的无标记、特异性检测，无需预清洗步骤。检测限达10 fg/mL，动态范围跨越11个数量级，芯片采用标准CMOS工艺制造，为床旁诊断提供了低成本、可规模化的技术路径。
研究背景
创伤性脑损伤和神经退行性疾病的准确诊断至今仍是临床难题。CT和MRI等神经影像技术虽广泛用于辅助诊断，但在急诊、偏远或资源有限场景下，其可及性、速度和灵敏度均难以满足早期微小病理的检出需求。GFAP是星形胶质细胞标志物，中枢神经系统损伤后释放入循环，在脑脊液和血液中均展现出作为脑病理标志物的潜力。对TBI而言，治疗决策需在数小时内完成，快速GFAP检测可支持分诊、影像决策和早期干预——这在偏远或军事环境中尤为迫切。神经退行性疾病则需要纵向监测和分层，GFAP可辅助追踪疾病进展和治疗反应。现有GFAP血清检测技术包括ELISA、电化学发光、荧光法和单分子阵列（Simoa）等。这些平台推动了标志物研究，但多依赖实验室环境、需要样本预处理，难以满足床旁或家庭护理场景的需求。
研究方法
2.1 三维（3D）数值计算
采用Synopsys公司的Sentaurus Device进行3D器件计算，对每个网格点求解泊松方程和连续性方程。血液被视为对称电解质，模拟为非简并半导体，带隙为1.5 eV，相对介电常数εᵣ = 80，离子强度为100 mM（n = p = NA C₀ × 10⁻³ cm⁻³，其中n和p分别为电子（阴离子）和空穴（阳离子）浓度，NA为阿伏伽德罗常数，C₀ = 0.1为摩尔浓度）。源漏距离为1 μm（沟道长度），p型区域间距为500 nm。栅介质厚度为5.5 nm（SI1）。n型沟道体积掺杂磷，浓度为0.9 × 10¹⁷ cm⁻³；n型源/漏区域掺杂磷，浓度为1 × 10¹⁹ cm⁻³；p型横向区域掺杂硼，浓度为2 × 10²⁰ cm⁻³。所有测量中背栅保持−2 V。为估算蛋白质-靶标结合效应，在栅介质-电解质界面、源漏中间及p型区域中间放置一个10 nm × 10 nm × 10 nm的SiO₂盒子。该盒子被赋予介电常数（εr）为2，与静电建模中蛋白质常见的低介电常数一致[20–27]。盒子界面电荷从+1e+变化至+1000e+（e+ = +1.6 × 10⁻¹⁹C）。
【数据】模拟软件：Sentaurus Device（Synopsys）；血液模拟参数：带隙1.5 eV，相对介电常数80，离子强度100 mM；源漏距离：1 μm；p型区域间距：500 nm；栅介质厚度：5.5 nm；n型沟道掺杂：磷，0.9 × 10¹⁷ cm⁻³；n型源/漏掺杂：磷，1 × 10¹⁹ cm⁻³；p型横向区域掺杂：硼，2 × 10²⁰ cm⁻³；背栅电压：−2 V；SiO₂盒子尺寸：10 nm × 10 nm × 10 nm；盒子介电常数：2；界面电荷范围：+1e+至+1000e+；e+电荷量：+1.6 × 10⁻¹⁹C
2.2 器件制造
MNC生物传感器由Tower Semiconductors采用互补金属氧化物半导体（CMOS）工艺制造。起始材料为绝缘体上硅（SOI）晶圆，器件层厚度145 nm，埋氧层（BOX）厚度400 nm。n型沟道体积（1 × 10¹⁷ cm⁻³）两侧翼以p++区域（2 × 10²⁰ cm⁻³）形成横向p-n结。制造的MNC生物传感器具有不同的两个p++区域间距——0.6、0.7、0.8、0.9和1 μm。下文将此间距称为W⁎。源极和漏极区域为重掺杂n型，间距10 μm，定义了沟道体积的长度。5.5 nm SiO₂栅介质的顶面为传感区域（后续用抗GFAP抗体进行生物功能化）。后端由四层金属堆叠构成，各层间以层间介质绝缘。整个芯片除传感区域和电学焊盘外，均以1 μm SiO₂钝化。
【数据】制造方：Tower Semiconductors；工艺：CMOS；起始材料：SOI晶圆；器件层厚度：145 nm；埋氧层厚度：400 nm；n型沟道掺杂浓度：1 × 10¹⁷ cm⁻³；p++区域掺杂浓度：2 × 10²⁰ cm⁻³；W⁎间距：0.6、0.7、0.8、0.9、1 μm；源漏间距：10 μm；栅介质厚度：5.5 nm；钝化层厚度：1 μm SiO₂
2.3 表面化学修饰与表征
基于抗体的识别层在1 cm × 1 cm、涂覆10 nm SiO₂层的硅基底上制备。基底先在乙酸乙酯、丙酮、2-丙醇和去离子（DI）水中各超声2分钟，随后旋转1分钟进行清洗。表面活化采用4分钟食人鱼溶液处理（4:1 H₂SO₄:H₂O₂），随后用DI水冲洗并用N₂干燥。活化后，将样品浸入0.1% v/v的3-氨丙基三甲氧基硅烷（APTMS，281778，Sigma-Aldrich）甲醇溶液中3小时。为去除过量APTMS，样品经历反复的超声和DI水洗涤循环。随后进行24小时水解，并在120 °C烘箱中孵育1小时。接着，将基底在0.5%戊二醛（340,855，Sigma-Aldrich）溶液中孵育40分钟，用10 mM磷酸盐缓冲盐水（PBS）洗涤，并用N₂干燥。样品在7.9 μg/mL抗GFAP抗体（G4546，Sigma-Aldrich）的10 mM PBS溶液中孵育12小时。孵育后，表面用10 mM PBS冲洗并用N₂干燥。表面表征使用接触角测量仪（Model OCA 20，Dataphysics）、椭偏仪（Alpha-SE Ellipsometer，J.A. Woollam）、电化学阻抗谱（EIS，Palmsens 4，Palmsens Inc.）和原子力显微镜（AFM，MFP-3D-Bio，Asylum Research/Oxford Instruments）。EIS测量在0.8 mL电化学池中、10 mM磷酸盐缓冲盐水（PBS）pH 7.4条件下进行。测量使用铂对电极（SEC-C Pt Gauze工作电极，ALS Japan）和Ag/AgCl参比电极（RE-1BP，ALS Japan）。工作样品背面划痕，用导电碳漆进行欧姆接触。AFM测量模拟生理条件，所有测量在150 mM PBS（pH 7.4）中进行。形貌成像使用硅悬臂探针（Olympus BL-AC40TS-C2），标称针尖半径为9 ± 2 nm。最后，对生物传感器执行化学表面功能化程序。
【数据】基底：1 cm × 1 cm硅片，10 nm SiO₂涂层；清洗：乙酸乙酯、丙酮、2-丙醇、DI水各超声2分钟+旋转1分钟；活化：食人鱼溶液（4:1 H₂SO₄:H₂O₂）4分钟；硅烷化：0.1% v/v APTMS甲醇溶液，3小时；水解：24小时；烘烤：120 °C，1小时；交联：0.5%戊二醛，40分钟；抗体：抗GFAP抗体7.9 μg/mL，12小时；EIS缓冲液：10 mM PBS，pH 7.4；EIS池体积：0.8 mL；AFM缓冲液：150 mM PBS，pH 7.4；AFM探针针尖半径：9 ± 2 nm
2.4 全血中MNC生物传感器传感测量
去标识化全血由以色列Kaplan医疗中心提供。全血供体单位收集于含CPD-1/CPDA抗凝剂的袋中，由血库处理为浓缩红细胞，并在4 °C下储存，未经进一步处理（血清也由以色列Kaplan医院中心血库提供）。测量使用多个此类血袋。全血中掺入靶分子GFAP。类似地，全血中掺入选定的对照分子：C反应蛋白（CRP，A60981，抗体）、人甲胎蛋白（AFP，Abcam，ab114216）和铁蛋白（ab281293，Abcam）。GFAP（及对照分子）在全血中的稀释系列跨越500 μg/mL至100 ag/mL的浓度范围，具体浓度点为：500 μg/mL、100 μg/mL、10 μg/mL、1 μg/mL、100 ng/mL、10 ng/mL、1 ng/mL、100 pg/mL、10 pg/mL、1 pg/mL、100 fg/mL、10 fg/mL、1 fg/mL和100 ag/mL。电学测量使用B1500半导体参数分析仪（SPA，Keysight Ltd）。生物芯片安装在探针台上，探针针尖接触晶体管电学焊盘，连接至SPA源测量单元（SMU）。所有电学测量在全血中进行（额外对照在PBS和血清中进行）。用移液器将0.5 μL未处理全血滴加至生物芯片传感区域。血液的离子强度和背景蛋白浓度分别为130.6 mM和27.5 mM（SI2，SI3）。确保液滴不扩散至焊盘区域或生物芯片边缘。血滴的电势由浸入其中的Ag/Ag+准参比电极确定。准参比电极由商用参比电极（012171 RE-7，ALS Co., Ltd）制备，去除玻璃外壳，暴露的银丝涂覆Ag/AgCl墨水（011464，ALS Co., Ltd）。准参比电极连接至B1500 SMU以确定电势并测量溶液漏电流。准参比电极浸入液滴后的前30秒内，电流-电压测量不可重复。此不稳定性归因于液滴物理不稳定性和分子相互作用。30秒后测量可重复，表明溶液-分子系统达到电化学平衡（SI5）。我们将MNC生物传感器称为“实时”传感器正是基于这30秒——提取可靠传感测量需要30秒。每个液滴测量两次，之后用洁净室级擦拭布去除血滴，接着用0.1% tween20的1× PBS溶液洗涤，再施加新的血滴。单次液滴测量持续时间约一分钟，期间进行两次连续电流-电压（IV）测量。血滴的有效寿命约为10分钟，超过后干燥导致测量重复性退化。
【数据】全血来源：Kaplan医疗中心，以色列；抗凝剂：CPD-1/CPDA；储存温度：4 °C；靶标：GFAP；对照分子：CRP、AFP、铁蛋白；浓度范围：500 μg/mL至100 ag/mL；浓度点：500 μg/mL、100 μg/mL、10 μg/mL、1 μg/mL、100 ng/mL、10 ng/mL、1 ng/mL、100 pg/mL、10 pg/mL、1 pg/mL、100 fg/mL、10 fg/mL、1 fg/mL、100 ag/mL；测量仪器：B1500 SPA（Keysight）；血滴体积：0.5 μL；血液离子强度：130.6 mM；背景蛋白浓度：27.5 mM；准参比电极：Ag/Ag+；平衡时间：30秒；单滴测量时长：约1分钟；血滴有效寿命：约10分钟
研究结果
MNC-FET生物传感器的设计专门针对活性传感界面处离散生物结合事件引起的局部生物分子门控挑战。通过利用多样化的静电定义导电沟道，该器件将非均匀表面电势分布最优地转换为放大的源漏电流（IDS）信号。此外，MNC生物传感器架构有效解耦了溶液电势与沟道电势，确保电解质和表面结合的生物分子复合物在整个传感测量过程中保持热力学和电化学平衡。如图1a的3D示意图所示，传感区域位于5.5 nm厚SiO₂栅介质的顶面，并用特异性受体分子（如抗体）进行生物功能化。操作过程中，样品液滴的电势由准参比电极（VGF）调控。活性n型沟道体积嵌入该介质正下方的绝缘体上硅（SOI）器件层中，总长度为10 μm，由简并n型源极和漏极区域定义。沟道宽度受横向简并p型区域约束，这些区域在与沟道体积的界面处形成p-n结，所有结构均与铝互连集成。沟道体积由四个独立栅极调制：两个由p-n结形成的横向栅极（VGL）、VGF和背栅（VGB）。这四个栅极在沟道体积内定义特定的耗尽区，施加负栅极电势可扩展相应的耗尽宽度。由于IDS是电子积累电流，其在沟道体积内的具体尺寸、形状和空间位置由周围耗尽区决定（见源漏中间的2D截面）。这使得电流路径可精确裁剪，以耦合传感区域处的局部电势扰动（结合事件）。这些扰动产生局部电场，穿透SiO₂栅介质，通过场效应现象影响特定区域的沟道电导。最终，该四栅系统提供的静电可调性允许定义与局部表面电势变化最优耦合的IDS，从而最大化对传感界面生物相互作用的灵敏度。我们将此平台称为“Meta”，以突出其激发多样沟道配置的能力——这是相对于传统bioFET器件单电流局限的重大进步。最后，沟道通过VGL从关态切换到开态，同时VGF保持固定电势，确保溶液和表面结合生物分子在传感测量期间保持电化学平衡[14]。
图2a显示了选定VGF和离子强度100 mM电解质条件下数值计算的IDS-VGL曲线（见方法和SI1）。IDS随VGL增加而增加，因为正VGL减小了沟道体积内的横向耗尽区（横向p-n结的正向偏置）。IDS也随VGF增加而增加，因为正VGF减小了沟道体积顶部的耗尽区。注意每个VGF和VGL组合定义了一个独特的IDS沟道。还提供了VGL = -0.1 V时源漏中间的电子密度分布2D截面（图2a右），此时VGF对沟道配置的影响显而易见。接着对MNC生物传感器的工作模式进行数值演示。为此，将一个10 nm × 10 nm × 10 nm、含单个正电荷e+ = +1.6 × 10⁻¹⁹C的盒子放置在传感区域中心（见SI1）。电荷位于传感区域内的盒子中。计算了选定VGF值下有无盒子时的IDS-VGL曲线。计算针对不同数量的正电荷重复进行，范围从e+ = 1–1000。图2b展示了选定VGF值和选定盒子内e+数量下的Inorm-VGL。Inorm定义为Inorm = (Icharges-Ibaseline) × 100/Ibaseline，其中Icharges和Ibaseline分别为有和没有盒子内电荷时计算的IDS。观察到几点：1）Inorm随e+数量增加而增加，因为这些电荷在沟道体积顶部诱导电子积累，导致IDS增加；2）较低的VGF提供更高的Inorm响应，因为顶部沟道体积被耗尽，定义了更窄的IDS沟道，对传感区域上的局部电荷更敏感；3）较低的VGL提供更高的Inorm响应，因为沟道体积的横向侧被耗尽，定义了窄IDS，同样对传感区域上的局部电荷更敏感。显然，IDS可调性提供了将局部分子门控（此处模拟为盒子中的电荷）转导为显著IDS变化的手段。图2c展示了由VGL = -0.1 V和六个VGF值定义的六个不同IDS沟道的提取校准曲线。电流随e+数量增加而增加是明显的。此外，较低的VGF提供更大的校准曲线斜率，等同于增加的灵敏度，如上所述。图2d显示了源漏中间相应的电子密度分布。显然，对于VGF = -0.5 V，沟道更窄，盒子中电荷对IDS的影响更大，与图2c的曲线一致。
图3a显示了MNC生物芯片的光学图像。连接电学焊盘的探针针尖清晰可见，0.5 μL血滴和浸入其中的准参比电极也可见。图3b显示了MNC生物传感器的倾斜二次电子显微镜（SEM）截面。图3c左侧提供了所选生物功能化策略的示意图（见方法，SI4）。图3c右侧展示了在修饰有抗GFAP抗体的MNC生物传感器传感区域上施加0.5 μL全血滴时，VGF = −1、−0.5和0 V的IDS-VGL曲线。MNC生物传感器的W⁎（横向p++区域间距，见方法）为0.8 μm。以下实验工作中VGB始终接地。测量程序详见方法部分。共测量15个液滴，每个液滴在收集前测量两次。图3c中的数据点为这些测量的平均值，误差棒为相应的标准差。重要的是，准参比电极浸入血滴后的约30秒内，液滴内测量不可重复，所呈现的数据反映此时间间隔后的测量（见方法，液滴稳定性测量见SI5）。两次液滴内测量持续约1分钟，之后收集液滴（见方法），并对下一个液滴重复该程序。时间分辨I-V测量（SI5）清晰展示了施加0.5 μL液滴和浸入准参比电极后的初始瞬态期。在前30秒内，观察到基线电流的明显漂移，这归因于双电层的建立和血液蛋白在电极界面的竞争性吸附。重要的是，我们的结果表明，在此初始30秒窗口后，系统达到稳健的电化学稳态。注意由于测量的高重复性，误差棒在视觉上无法辨别（见插图）。这种重复性验证了MNC生物传感器和准参比电极相对于随机波动的稳定性。
图4a-c分别展示了VGF = -1 V、−0.5 V和0 V时，不同GFAP浓度（100 ag/mL至500 μg/mL，W⁎ = 0.8 μm）下的IDS-VGL和Inorm-VGL曲线。每个浓度（液滴）测量两次。数据点和误差棒分别表示平均值和标准差。
图5展示了全血中GFAP传感的结合曲线。(a-d) 两个W⁎ = 0.8 μm和两个W⁎ = 0.9 μm的MNC生物传感器的结合曲线。IDS沟道由VGF = −1、−0.5和0 V以及各种VGL值定义。(e-h) W⁎ = 0.8 μm和W⁎ = 0.9 μm以及两个VGF值下的结合曲线。
讨论与解读
本研究首次展示了在未处理全血样本中、无需预测量清洗步骤的情况下，对GFAP进行特异性、无标记、定量、实时传感。MNC芯片的估计研发成本约为0.5美元，为床旁低成本传感铺平了道路。MNC生物传感器被视为实时响应，因为液滴需要30秒达到电化学平衡，之后进行测量。该传感器通过标准CMOS工艺实现，为大规模商业化和超小样本体积内的高密度多重检测提供了无缝路径。借助CMOS技术固有的微型化和可扩展性，该平台允许外围电路的单片集成，而不产生额外的制造开销。这种架构协同显著降低了所需仪器的复杂性，使高性能传感能够与低成本电子读取器或普及的消费平台（如传统智能手机）耦合。最终，MNC生物传感器的CMOS特性使其成为分散式床旁诊断的稳健、可及解决方案。本工作的主要目标是提出概念验证可行性研究和严格的生物物理表征。
编译者解读：该研究的核心价值在于用CMOS工艺将FET生物传感的“溶液电位干扰”和“局部门控”两大难题通过四栅架构解耦，实现了全血直接检测。0.5 μL样本量、10 fg/mL检测限和11个数量级动态范围在同类工作中表现突出。但需注意，30秒平衡时间和单滴约1分钟测量时长对“实时”定义提出了实际约束；此外，研究虽展示了对照分子特异性验证，但全血中复杂基质对长期稳定性的影响仍需更多临床样本验证。CMOS兼容性是其走向量产的关键优势。
参考来源
期刊：Chemical Engineering Journal, 2026
DOI: 10.1016/j.cej.2026.181784
DOI: 10.1016/j.cej.2026.181784