螺旋藻耦合原油修复与PHB合成的营养模式工程化生物工艺

来源：Integrated bioprocess engineering of Spirulina platensis for crude-oil phycoremediation and enhanced PHB biosynthesis under optimized trophic regimes（Biomass and Bioenergy）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription

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导读

原油污染与可持续材料需求正形成交汇的全球性挑战。本研究以螺旋藻（Spirulina platensis）为底盘，在1%（w/v）原油富集培养基中系统优化了光自养、异养（含/不含葡萄糖）和混养七种营养模式，并引入DMSO作为膜通透性增强剂。原油暴露在光自养和异养条件下刺激了生物量产出；氮限制虽降低总细胞量，却将碳流导向储存代谢，使PHB积累提升最高达10倍，脂质和碳水化合物产量在光自养和混养氮缺陷处理下提高约100%。GC-MS显示多数条件下短链脂肪烃（C10–C24）去除率超过80%。Haldane动力学模型（R² > 0.95）定量描述了底物依赖的生长与降解动态。

研究背景

原油泄漏是 aquatic 生态系统面临的最严峻持久环境问题之一。每年约130万吨原油进入水生生态系统，对陆生和水生生物构成严重威胁。溢油中复杂的烃类混合物可导致致癌、致突变和生殖损伤，严重损害生态系统健康。现有修复方法包括机械、物理和化学手段，虽有效但成本高昂，且可能进一步危害环境。生物修复利用微生物固有代谢能力降解有毒化合物，更为可持续且经济。蓝细菌因兼具环境解毒和高值生物产品合成双重功能而备受关注。螺旋藻（Arthrospira platensis）是生物修复和污染物去除的模型生物，这种商业上重要的蓝细菌能在多种营养模式下生长，包括光自养、异养和混养。本研究将原油植物修复与PHB生物合成耦合，通过营养模式工程、氮调控和DMSO增强通透性的协同策略，建立螺旋藻双功能平台。

研究方法

2.1 细胞悬液制备与实验设计

S. platensis 在改良Zarrouk培养基（13.5 g L⁻¹ NaHCO₃）中培养，温度26 ± 1°C，光暗周期16:8 h（120 μmol photons m⁻² s⁻¹），起始OD₇₅₀ = 0.5。培养维持12天，设置三种营养模式：光自养（Photo）、异养含葡萄糖（HET）、异养不含葡萄糖（hET）和混养（Mix，含葡萄糖）。由于异养条件分为hET和HET两种，因此共设计四种条件。原油以0–2%（w/v）引入（图S1）；基于最佳干重选择1%用于后续研究（OT）。氮缺陷（ND）以C/N比35:1施加，以诱导PHB生产并刺激生物降解速率。C/N比基于NaHCO₃和NaNO₃监测。原油和葡萄糖作为独立变量，不计入C/N比。DMSO首先在0.001–0.1 mol%范围内测试（图S2），因生物量产量最高而选择0.02 mol%用于后续实验。仅报告DMSO处理的生长指标、PHB生产和烃降解结果。细胞通过离心收获、洗涤，并在分析前进行冻融、超声和涡旋处理。生长速率在12天内监测（图S3–4）。酶活性、PHB含量和残留烃在第12天测定，其他生理指标在第1天和第12天评估。表1显示实验设计。为确保藻培养物无污染，除初始多通道荧光显微镜检查外，在整个12天实验期间通过定期将培养样品涂布于营养琼脂和LB（Luria–Bertani）琼脂培养基上主动监测无菌性。在任何采样时间点孵育后均未观察到细菌或真菌菌落，提供了培养物无活体污染物的微生物学确认。所有接种步骤均在层流柜中严格无菌条件下进行，使用高压灭菌的培养容器和Zarrouk培养基。Zarrouk培养基的碱性pH（~9.5）和高碳酸氢盐浓度（13.5 g L⁻¹）提供了额外的生态选择性，强烈抑制大多数异养细菌污染物的生长。

【数据】培养基：改良Zarrouk（13.5 g L⁻¹ NaHCO₃）；温度：26 ± 1°C；光暗周期：16:8 h；光照强度：120 μmol photons m⁻² s⁻¹；起始OD₇₅₀：0.5；培养时间：12天；原油浓度：0–2%（w/v），选用1%；C/N比：35:1；DMSO浓度：0.001–0.1 mol%，选用0.02 mol%；离心条件：12,500 g，20 min；pH：~9.5

2.2 生长与色素指标评估

藻生长通过浊度（OD₇₅₀）、鲜重（FW）、干重（DW）和细胞产率（Px，方程(1)）评估。OD用分光光度法测定。生物量定量时，取10 mL培养液在12,500 g离心20 min，用蒸馏水洗涤两次，称重得FW。DW在75°C干燥6 h后获得。生长参数用方程(1)计算。

Px（mg L⁻¹ day⁻¹）= (Xm − Xi) / tm

其中Px为细胞产率；Xm为最大细胞干重（mg L⁻¹）；Xi为初始细胞干重（mg L⁻¹）；tm为培养天数。

色素组成用已建立的溶剂提取方法评估。叶绿素a和类胡萝卜素从新鲜生物量中用甲醇提取，藻胆素用磷酸钾缓冲液（pH 7.0）分离。虾青素从干生物量中用DMSO溶剂提取，在482 nm记录吸光度，使用消光系数1.25 × 10⁵ L mol⁻¹ cm⁻¹定量。所有色素浓度用T80紫外-可见分光光度计（PG Instruments Co., England）测定，按方程S(1)–(6)计算。

【数据】离心条件：12,500 g，20 min；干燥温度：75°C；干燥时间：6 h；虾青素检测波长：482 nm；消光系数：1.25 × 10⁵ L mol⁻¹ cm⁻¹；缓冲液pH：7.0

2.3 碳水化合物和酚类含量测定

总可溶性碳水化合物从干生物量中用乙醇提取定量。样品用蒽酮试剂和浓H₂SO₄（72%）处理，沸水浴加热15 min，冷却后测625 nm吸光度。浓度根据葡萄糖标准曲线计算。总酚含量用80%甲醇提取生物量测定。提取液与Folin–Ciocalteu试剂和20%碳酸钠反应，涡旋后在室温暗处孵育1 h。在765 nm读取吸光度（Epoch分光光度计，BioTek，UK），基于没食子酸标准曲线定量。

【数据】H₂SO₄浓度：72%；沸水浴时间：15 min；检测波长：625 nm（碳水化合物）、765 nm（酚类）；甲醇浓度：80%；碳酸钠浓度：20%；暗处孵育时间：1 h；温度：室温

2.4 氧化应激和酶活性测定

为评估S. platensis的氧化应激，测量三个关键指标：活性氧（ROS）、DPPH清除能力和脂质过氧化。ROS从新鲜生物量中用50 mM磷酸钠缓冲液（pH 6.8）提取，使用二甲酚橙定量，在560 nm记录吸光度。抗氧化活性通过将干生物量的甲醇提取物加入DPPH溶液，在517 nm读取吸光度评估（方程(2)）。

Activity（%）= (Ac − At) / Ac × 100

其中Activity为DPPH抑制百分比；At为提取样品吸光度；Ac为无提取物的甲醇DPPH溶液（空白样品）吸光度。

脂质过氧化通过丙二醛（MDA）定量测定，用5%三氯乙酸提取，在450、532和600 nm分光光度法测量。与烃降解和抗氧化防御相关的酶活性在含或不含1%（w/v）原油培养12天后分析。新鲜生物量在提取缓冲液中匀浆，冻融、超声，离心（12,500 g，20 min，4°C）后取上清液用于测定。过氧化氢酶（CAT）活性在240 nm测量（消光系数2.3 mM⁻¹ cm⁻¹）。过氧化物酶（POD）活性（使用焦性没食子酚）在430 nm测定（消光系数2.47 mM⁻¹ cm⁻¹）。脱氢酶活性在485 nm定量，脲酶活性在578 nm定量。总可溶性蛋白用Bradford法测定。此外，细胞色素P450在原油降解中的参与用2,6-DCPIP法评估（第2.5.2节）。

【数据】磷酸钠缓冲液浓度：50 mM；pH：6.8；ROS检测波长：560 nm；DPPH检测波长：517 nm；三氯乙酸浓度：5%；MDA检测波长：450、532、600 nm；离心条件：12,500 g，20 min，4°C；CAT检测波长：240 nm；CAT消光系数：2.3 mM⁻¹ cm⁻¹；POD检测波长：430 nm；POD消光系数：2.47 mM⁻¹ cm⁻¹；脱氢酶检测波长：485 nm；脲酶检测波长：578 nm；原油浓度：1%（w/v）；培养时间：12天

2.5 PHB定量、烃降解和副产物分析

#### 2.5.1 PHB定量

在含1%（w/v）原油培养12天后，培养液离心（12,500 × g，20 min，20°C）。沉淀洗涤后用4%次氯酸钠处理20 min，冲洗，用丙酮搅拌10 min，在10°C空气干燥8 h。干燥生物量（40 mg）与等体积氯仿和酸化甲醇（3%硫酸）混合，在密封玻璃瓶中100°C消化8 h。消化过程中，PHB同时解聚并原位酯交换为其甲酯衍生物，遵循Oehmen等人（2005）的方法。通过加水振荡实现相分离，所得氯仿相与0–3 mg PHB标准品（R-3-羟基丁酸，3HB，Sigma–Aldrich，Germany）标准曲线及苯甲酸钠内标一起用GC-MS分析。GC-MS分析使用Shimadzu GC-17 A气相色谱仪（Kyoto，Japan）与QP5050质谱仪联用，配备DB-5柱（30 m × 0.25 mm I.D. × 0.25 μm膜）。质谱仪在70 eV扫描模式下运行，质量范围40–600 amu（扫描速度：2000 amu s⁻¹；间隔：0.3 s）。化合物对照NIST08和Wiley 9.0谱库鉴定。实验终点（第12天）PHB含量以藻生物量干重百分比（% DW）表示。选择此归一化而非体积单位（g L⁻¹），因为实验处理——营养模式、原油暴露、氮缺陷和DMSO补充——预期会差异性地影响生物量和PHB积累。

【数据】离心条件：12,500 × g，20 min，20°C；次氯酸钠浓度：4%；处理时间：20 min；丙酮搅拌时间：10 min；空气干燥温度：10°C；干燥时间：8 h；干燥生物量：40 mg；硫酸浓度：3%；消化温度：100°C；消化时间：8 h；PHB标准品：0–3 mg R-3-羟基丁酸；GC-MS柱：DB-5（30 m × 0.25 mm I.D. × 0.25 μm）；电离能：70 eV；质量范围：40–600 amu；扫描速度：2000 amu s⁻¹；扫描间隔：0.3 s

#### 2.5.2 烃降解（2,6-DCPIP法）

烃降解潜力和细胞色素[原文截断]

【数据】原文未详述

研究结果

3.1 培养纯度与丝状体完整性评估

在启动实验处理前，进行荧光显微镜检查以验证Spirulina platensis培养物的纯度和结构完整性。多通道成像（蓝、绿、红发射光谱）显示干净、连续的丝状体，表现出健康螺旋藻细胞特征的均匀自发荧光模式（图1 A-C）。在任何通道中均未检测到外来微藻物种、异养细菌聚集体或碎片。合并的多色图像进一步确认无形态异常或细胞断裂。此外，通过定期将培养样品涂布于营养琼脂和LB琼脂培养基上主动监测无菌性。在任何采样时间点孵育后均未观察到细菌或真菌污染，表明培养物为无菌且适合下游生理生化分析。这些观察确保后续色素谱、酶活性、PHB积累或烃降解的变化可归因于施加的处理，而非初始培养污染或丝状体损伤。

【数据】成像通道：蓝、绿、红；检测结果：无外来微藻、细菌聚集体或碎片；琼脂培养基：营养琼脂和LB琼脂；污染检测：无细菌或真菌菌落

3.2 处理对光合色素的影响

叶绿素a（Chl a）水平在不同营养条件间差异显著（图2a）。原油处理（OT）在光自养和HET培养中均提高Chl a——第1天分别提高26.5%和13.8%，第12天分别提高22.7%和6.5%——而在Mix培养中效果仅在第1天明显（13.2%）。氮缺陷降低Chl a，尤其在12天后，且原油补充未能完全抵消这一下降。HET培养的Chl a始终高于hET，原油在葡萄糖补充条件（HET）下增强了这一效果。类胡萝卜素（Car）含量（图2b）呈现与Chl a相似的模式。总体上，Car水平从第1天到第12天增加，但hET和HET条件下下降。氮缺陷在所有处理中降低Car含量，但初始Photo条件除外。原油补充在第1天和第12天均促进Photo和HET培养中类胡萝卜素积累，在氮限制Photo条件下第1天（Photo–N + Oil）或第12天HET-N + Oil也如此。虾青素浓度在所有营养模式中稳步上升，趋势（图2c）与藻胆素色素相似。然而，在氮缺陷下，原油在第12天未能增强Photo和Mix处理中的色素积累。最高虾青素含量出现在Photo + Oil培养中，其次是Mix对照，均在第12天。相反，不含葡萄糖的异养条件产生最低色素水平。总体而言，最高色素积累（Chl a、类胡萝卜素、藻胆素和虾青素）在Mix条件下加入原油后最初24 h内观察到，之后到第12天下降。但最高最终量总是在第12天Photo条件下记录到。

藻蓝蛋白（PC）、别藻蓝蛋白（APC）和藻红蛋白（PE）如图3a–c所示，在12天期间总体增加，但hET条件下无葡萄糖时PC除外。总藻胆素变化模式与PC和PE更相似（图S5）。这些辅助色素对各种处理的响应与Chl和Car相似，仅有微小差异。S. platensis中最高藻胆素含量在Photo条件下OT处理12天后观察到，其次是Mix条件下的对照。然而，与Photo条件下的效果相反，Oil在Mix（第12天）和hET条件（第1天和第12天）下显著（P < 0.05）降低藻胆素水平。葡萄糖的存在逆转了这一趋势，导致HET条件下Oil处理藻中藻胆素色素增加。氮缺陷在所有条件下降低藻胆素水平。但OT（hET除外）能够抑制色素降解，第12天观察到显著改善。

【数据】Chl a提升：Photo第1天26.5%、第12天22.7%；HET第1天13.8%、第12天6.5%；Mix第1天13.2%；Oil降低藻胆素：Mix第12天、hET第1天和第12天（P < 0.05）；最高虾青素：Photo + Oil第12天；最高藻胆素：Photo + OT第12天

3.3 总可溶性碳水化合物、蛋白质和脂质含量变化

总可溶性碳水化合物含量在所有条件下随时间增加，OT对碳水化合物水平有正向影响（图4a）。最显著增加在–N + OT下观察到，尤其是Mix条件，其次是12天后的Photo条件。最低碳水化合物含量记录在不含葡萄糖的异养条件（hET）。蛋白质含量在Photo、HET和Mix条件下总体响应OT而增加，尤其在第1天和第12天（图4b）。但在无葡萄糖（hET）时，氮饥饿和OT均未显著改变蛋白质水平。氮缺陷在所有条件下显著降低蛋白质含量，但OT部分缓解了这一下降，尽管水平仍低于对照。在hET和HET条件下，第12天蛋白质含量低于处理后次日，与Chl a含量趋势平行。S. platensis脂质含量在Photo条件下OT处理及氮饥饿下第12天显著增加（图4c）。值得注意的是，OT联合氮缺陷（Photo-N + Oil）导致脂质产量大幅增加，尤其在第12天（分别比Photo对照和Photo-N高123.3%和70%）。然而，在Mix条件下，单独Oil未诱导脂质生产，而氮缺陷和联合–N + OT显著增强。异养条件下大多数处理未诱导脂质生产。

【数据】脂质增加：Photo-N + Oil第12天比Photo对照高123.3%，比Photo-N高70%；碳水化合物最高：–N + OT Mix条件；蛋白质最低：hET条件

3.4 氧化剂与抗氧化剂细胞动态

氧化剂和抗氧化系统评估显示，ROS水平在hET条件下最高，尤其hET-N + Oil（图5a）。OT在黑暗和无葡萄糖下导致显著ROS产生，氮缺陷进一步加剧。次高ROS水平在黑暗+葡萄糖条件下观察到，最大值在HET-N + Oil。相反，最低ROS水平在Photo条件下记录，尽管OT和氮缺陷增加ROS水平。Mix条件下观察到类似模式，Oil和氮缺陷诱导的ROS水平高于Photo条件。DPPH清除活性与ROS水平呈反比关系，hET和HET条件下活性最低（图5b）。在hET下，OT未能增强抗氧化活性，而在HET下则能增强。Photo和Mix条件表现出更高的DPPH清除，峰值活性在Photo + Oil，其次是Mix对照。其他处理降低Photo和Mix条件下的抗氧化活性。丙二醛（MDA）含量——脂质过氧化指标——与ROS趋势一致，最高MDA水平按以下顺序记录：hET-N + Oil > hET + Oil > HET-N + Oil（第12天）（图5c）。相反，最低MDA含量在Photo条件下观察到，即使联合Photo-N + Oil处理也低于其他条件。酚类含量也呈现与ROS水平相似的模式。无葡萄糖hET条件下酚含量较高（约10.6 mg g⁻¹ DW，图S6）。OT使hET + Oil中酚积累比对照增加38%，氮缺陷诱导增加28–30%。在hET-N + Oil下，酚类物质诱导至高于hET + Oil的水平。相反，在含葡萄糖HET条件下，氮缺陷对酚类化合物诱导的影响大于OT（第1天和第12天分别比单独HET增加65.2–69.3%）。Mix对照藻的酚含量低于Photo，但Oil和氮缺陷处理能将其提升至高于Photo条件的水平。酶活性[原文截断]

【数据】最高ROS：hET-N + Oil；酚含量：hET约10.6 mg g⁻¹ DW；OT使hET + Oil酚增加38%；氮缺陷诱导酚增加28–30%；HET下氮缺陷酚增加65.2–69.3%；MDA最高：hET-N + Oil > hET + Oil > HET-N + Oil（第12天）

3.5 烃降解能力评估

[原文在此处截断，以下内容基于摘要和讨论中提及的结果]

【数据】短链脂肪烃（C10–C24）去除率：>80%；Haldane模型R² > 0.95

讨论与解读

4.1 生长参数、碳封存及脂质/碳水化合物生产

原油及相关处理对S. platensis生长的影响通过12天内的浊度（OD₇₅₀）和干生物量评估。OD与DW强相关（P < 0.01，R = +0.89）。1%原油时生长最佳，更高浓度因毒性降低生物量，与早期报道一致。DMSO作为膜穿透增强剂，改善油摄取和生物量产量，尤其在Photo、HET和Mix模式或氮限制下。即使无油，单独DMSO也促进适度生物量增加，可能通过增强膜通透性和营养摄取。效果取决于剂量和暴露时间。尽管DMSO在本研究实验室规模下表现出作为膜通透性增强剂的效果，但其在大规模植物修复系统中的潜在应用值得仔细考虑。它被广泛描述为极性非质子溶剂，在环境相关浓度下具有低急性毒性和良好生物相容性。在生态毒理学研究中，它常被用作疏水性有机化合物的载体溶剂，因其强溶剂化能力和增强水分散性的能力。然而，尽管其固有毒性低，DMSO可影响共存污染物的环境归趋[原文截断]。

编译者解读

该研究将螺旋藻从传统营养补充剂拓展为"修复+合成"双功能底盘，策略清晰：用营养模式切换和氮限制重定向碳流，以DMSO破解疏水底物传质瓶颈。最亮眼的是PHB提升10倍与烃去除率>80%的同步实现，说明代谢负担可被营养工程解耦。局限在于DMSO的大规模环境归趋尚未验证，且Haldane模型虽拟合良好但未纳入光强动态。对合成生物学而言，该工作提供了"胁迫即诱导"的天然调控逻辑——氮限制作为零成本开关，值得在更复杂底物中检验。

参考来源

期刊：Biomass and Bioenergy, 2027

DOI: 10.1016/j.biombioe.2026.109708

DOI: 10.1016/j.biombioe.2026.109708