来源：蛋白热稳定性差差示扫描荧光优化（DNA Lab Space 实验教程）| 编译：DNA Lab Space
做DSF测Tm，曲线像面条？Tm比活性 assay 低10°C？别急着换蛋白。大概率是缓冲液、染料、浓度或升温速率在捣乱。本文从低级错误、样品条件、仪器参数到数据拟合，按实验流程拆开讲。你照着跑一遍，多数“热稳定性差”都能定位。
第一步：快速排查低级错误
1. 缓冲液里DMSO超过1%？SYPRO Orange母液是DMSO，蛋白也怕DMSO。解决：终浓度压到1%以下，设DMSO对照。
2. 染料直接加1 µL 5000×？终浓度变250×，荧光饱和。解决：算好终浓度5×，先用缓冲液稀释10×。
3. 蛋白浓度低于0.05 mg/mL？信号淹没在背景里。解决：浓缩到0.1–0.5 mg/mL，BCA定浓度。
4. 孔里有气泡或没封膜？曲线跳、边缘孔先蒸发。解决：1000 rpm离心1 min，封PCR膜，边缘孔加200 µL水。
第二步：分维度系统排查
1. 缓冲液pH和离子强度
现象：Tm偏低，曲线毛刺，首点荧光高。
原理：pH改变表面电荷，低盐加重聚集。
解决：换20 mM HEPES pH 7.5，加150 mM NaCl。蛋白pI 6.0时，避开pH 5.5