来源：无细胞表达沉淀物复溶优化（DNA Lab Space 实验教程）| 编译：DNA Lab Space
做无细胞表达（CFPS），最怕看到这一幕：反应结束，离心，上清干净得像没加过模板，目标蛋白全躺在沉淀里。你加尿素去溶，勉强溶开了；一透析，又絮成一团。别急着怀疑体系不行。无细胞体系的沉淀和传统包涵体不是一回事，复溶路径也完全不一样。本文按"先排低级错误、再按流程分维度排查、最后攻疑难"的顺序，把洗涤、溶解、复性、体系侧预防四段串起来，参数全部给实，照着做就行。
第一步：先排低级错误
离心条件用错。 无细胞反应液通常14000×g、4°C离心10分钟就够沉下不溶物；你要是上100000×g超离，核糖体和大分子复合物会一起沉下来，你会把本来该在沉淀里的东西误判成目标蛋白。换回14000×g再测一次。
pH没避开等电点。 目标蛋白pI是6.2，你却用pH 6.0的Tris去溶，溶解度直接掉一半。同一buffer设pH 7.0、8.0、8.5三组平行做。
定量方法选错。 Bradford碰到0.5% Triton X-100或Sarkosyl读数虚高；BCA遇到6M尿素同样不准。含去污剂走BCA去污剂兼容方案，含尿素直接跑胶定量。
把凝胶加样孔里的颗粒当成沉淀蛋白。 上清和沉淀必须双泳道对照，只跑沉淀一孔就下结论，十次有八次判断错。
第二步：按流程分维度系统排查
1. 沉淀到底是哪一类
现象。 沉淀里有目标条带，但复溶率低，稀释后浑浊。
原理。 CFPS的沉淀至少三类：真包涵体（错误折叠聚集）、膜/脂质结合蛋白、未反应模板与大分子复合物。三者复溶逻辑完全不同，混着处理必然失败。
怎么判断。 取等量沉淀分三管。A管：PBS+1M NaCl。B管：PBS+1% Triton X-100。C管：PBS+2M尿素。各4°C孵育30分钟，14000×g离心10分钟，四个泳道（三个上清+残余沉淀）跑胶。
怎么解决。 A管放出来的蛋白基本可直接回用；B管释放说明是膜结合型，后面要补脂质；只有C管才值得走完整复性流程。
验证。 目标条带出现在哪一管上清，分类就定了。
2. 洗涤不彻底
现象。 溶解后溶液发黏、偏黄棕，过柱柱压飙升。
原理。 核糖体、tRNA、PEG、Mg²⁺和脂质会跟着沉淀走，它们把复性buffer的离子强度搅乱。
怎么解决。 三步洗：0.5% Triton X-100/PBS，4°C、10分钟；1M NaCl/PBS，同条件；最后PBS洗一遍。每步14000×g、4°C、10分钟。
验证。 洗涤上清A260/A280降到0.6以下，说明核酸和杂蛋白洗得差不多了。
3. 溶解剂选型和浓度
现象。 6M尿素溶2小时还有絮状物；换8M溶开了，一稀释立刻再沉淀。
原理。 尿素主要打断氢键，对疏水聚集力弱；盐酸胍更强，但失活更彻底。Sarkosyl（N-月桂酰肌氨酸钠）适合难溶膜蛋白，1-2%就够，缺点是不好去除。
怎么解决。 首选6-8M盐酸胍/50mM Tris pH 8.0/5mM DTT，室温30分钟，多数CFPS沉淀能溶到90%以上。膜蛋白改用1.5% Sarkosyl/PBS，室温20分钟。尿素别超8M，否则异氰酸酯化会修饰你的蛋白。
验证。 溶解后14000×g离心10分钟，上清跑胶，目标条带几乎全在上清即到位。
4. 复性方式决定成败
现象。 溶解上清澄清，透析过夜后出现大量絮状沉淀。
原理。 复性速率过快，疏水面暴露、分子间碰撞，形成新的聚集体。
怎么解决。 三选一。稀释复性：溶解液按1:20体积比缓慢滴入复性buffer（50mM Tris pH 8.0、150mM NaCl、5%甘油、0.5M L-精氨酸），4°C磁力搅拌，滴速不超过1mL/min。梯度透析：8M→4M→2M→0M，每步4小时、4°C。层析复性：His标签蛋白挂Ni柱，尿素线性梯度6M降到0M，总时长3小时。L-精氨酸别省，0.4-0.5M能明显压住聚集。
验证。 复性后离心取上清做SEC-HPLC，主峰占比超70%说明单体化合格。
5. 体系侧预防
现象。 同一个模板，昨天可溶，今天全沉淀。
原理。 CFPS可溶性跟Mg²⁺、能量再生、氧化还原对直接挂钩。Mg²⁺从12mM提到16mM，部分蛋白就翻车。
怎么解决。 谷氨酸钾控80-120mM，Mg²⁺ 10-14mM，GSH/GSSG保持4:1（2mM/0.5mM）。反应温度降到25°C或18°C、延长到4-6小时，不少蛋白溶解度直接翻倍。
验证。 同批次做25°C和37°C两组，双泳道对比，一眼看出温度效应。
第三步：进阶疑难
含二硫键的蛋白。 沉淀里往往是错配二硫键。先用10mM DTT溶开，再在复性buffer里换成GSH