来源：蛋白交联分析质谱鉴定位点（DNA Lab Space 实验教程）| 编译：DNA Lab Space
跑完一轮 XL-MS，搜库出来只有二十几个交联位点，SDS-PAGE 上那条高分子量 smear 却明明很漂亮。这种落差是这行最常见的挫败。问题往往不在质谱本身，而在交联反应、酶切、分馏、搜库参数里的某一环。下面按实验流程拆成四步，从最低级的错误一路排到进阶疑难，每一步都给判断方法和具体参数。
第一步：先别怀疑方法，这几个低级错误占了七成
1. DSS 用水溶，或者母液在冰上放了半天。 DSS 遇水就水解，半衰期只有几十分钟。必须用无水 DMSO 或 DMF 配 50 mM 母液，现配现用，超过 2 小时基本报废。
2. 缓冲液里有 Tris 或甘氨酸。 这些伯胺会抢先消耗交联剂，蛋白根本没机会交联。换成 PBS 或 20 mM HEPES pH 7.4，带 Tris 的样品先脱盐。
3. 蛋白浓度太低。 0.2 mg/mL 的稀样品，分子间碰撞概率低到可以忽略。超滤浓缩到 1–2 mg/mL 再交联。
4. 淬灭和还原烷基化没做全。 交联后加 Tris-HCl pH 8.0 至终浓度 50 mM，室温 15 分钟淬灭；再用 5 mM DTT 37°C 30 分钟、25 mM 碘乙酰胺室温避光 30 分钟。
第二步：按流程拆——从交联到搜库逐个排
1. 交联剂与蛋白的摩尔比没摸过条件
现象：SDS-PAGE 上看不到高分子量 smear，或者整条泳道全堵在加样孔里。
原理：比例太低，分子间交联几乎不发生；比例太高，蛋白瞬间聚成不可溶团块，酶切也切不动。
解决：固定蛋白量，做 1:1、5:1、10:1、25:1、50:1 的摩尔比梯度，室温反应 30 分钟（或 4°C 2 小时）。选 smear 最丰富、加样孔不堵的那一档。
验证：每管取 2 μg 跑 4–12% 梯度胶，考马斯染色。看不到明显 smear 就别往下走，上质谱也是白烧柱子。