来源：蛋白降解多蛋白酶抑制剂（DNA Lab Space 实验教程）| 编译：DNA Lab Space
跑WB，目标条带下面拖着一排杂带，或者干脆断成两条。你加了cocktail，换了新批次，问题照旧。别急着怀疑抗体。九成情况是抑制剂体系或者操作链路上有漏洞。这篇按实验流程从头拆一遍：取材、抑制剂配制、裂解、超声、样品保存，每一步都给判断方法、验证动作和具体参数，最后补三个进阶疑难。
第一步：先排这三个低级错误
1. PMSF加了，但它是"一次性"的。
现象：早上配的裂解液，下午再用就没抑制效果。PMSF在水相里半衰期只有30-60分钟（pH 7.4、4°C），室温更快。解决：100 mM DMSO母液-20°C分装，用前才加，终浓度1 mM，现配现用。
2. cocktail买了一管，却没看它抑制哪几类酶。
丝氨酸蛋白酶压住了，金属蛋白酶照样切。翻说明书确认覆盖谱——多数商品cocktail不含EDTA，得你自己补2-5 mM EDTA或EGTA。
3. 全程室温操作。
降解带明显，但抑制剂浓度没错，那大概率是温度。裂解、离心、取样全在冰上或4°C，离心用预冷转子，12000×g跑15分钟。
第二步：按流程分模块系统排查
模块一：取材与起始样品
1. 组织块在冰上"慢慢切"。
现象：同一批动物，有的样品干净，有的多出好几条低分子量杂带。离体后细胞内钙离子释放，钙依赖蛋白酶（calpain）几分钟内就被激活。取材后立刻投液氮速冻，切块在干冰上做，别在冰盘上摆弄十分钟。验证方法很直接：同一组织取两份，一份液氮速冻，一份冰上放15分钟再冻，跑胶比对，后者多出杂带就是它。
2. 细胞用胰酶消化过头。
胰酶本身就是丝氨酸蛋白酶，过度消化会带着它进裂解液，全细胞裂解液里就冒出大量低分子量条带。改用细胞刮刀直接刮，或者胰酶消化后立即用含血清培养基中和，300×g离心5分钟，洗两遍PBS。
模块二：抑制剂体系本身
3. 抑制剂谱和目标蛋白酶不匹配。
现象：加了cocktail，目标蛋白仍出现固定分子量的截短带。不同蛋白酶家族要不同抑制剂——丝氨酸类用PMSF/AEBSF、Aprotinin；半胱氨酸类用E-64、Leupeptin；天冬氨酸类用Pepstatin A；金属类用EDTA、Bestatin。稳妥做法是直接上广谱cocktail，或者自配：1 mM PMSF + 1 µg/mL Leupeptin + 1 µg/mL Pepstatin A + 1 µg/mL Aprotinin + 5 mM EDTA + 1 mM DTT，冰上现配现用。
4. 浓度拍脑袋，只看"加了一滴"。
批次之间重复性差，往往就坏在这里。Leupeptin常用终浓度1-10 µg/mL，Aprotinin 1-2 µg/mL，Pepstatin A 1 µg/mL，E-64 1-10 µM，EDTA 1-5 mM，不同实验之间差10倍都正常。母液按1000×配，裂解液里1:1000加，每批记录批号和终浓度。
模块三：裂解与破碎
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