来源：质谱肽段覆盖低酶切时间（DNA Lab Space 实验教程）| 编译：DNA Lab Space
做质谱最怕什么？样本跑完，搜库只鉴定到十几个肽段，覆盖不到20%。老师第一句就是“酶切时间够吗”。你过夜了，还是低。别急着怪仪器。覆盖低往往不是单一原因，样本裂解、还原烷基化、胰酶活性、脱盐、LC-MS、搜库参数都可能拖后腿。本文按实验流程拆成快速排查、系统排查、进阶疑难，给你具体参数和验证方法，帮你把“酶切时间”这口锅摘清楚。
第一步：快速排查低级错误
1. 样本量太低或酶量比例离谱。考染看不到条带，溶液酶切蛋白少于1 μg，胰酶却只加10 ng，肽段自然少。解决：先BCA定量，蛋白:胰酶按50:1到20:1，37°C酶切4-18 h。
2. 还原烷基化漏做或浓度不够。DTT用10 mM，56°C 30 min；IAA用20-50 mM，室温避光30 min。漏了这步，二硫键锁住蛋白，胰酶切不进去。
3. 胰酶反复冻融或缓冲液不对。胰酶分装10 μL/管，-80°C保存，用50 mM NH4HCO3 pH 7.8-8.0重悬。别用含SDS、Triton的缓冲液直接酶切，胰酶会失活。
4. 脱盐把肽段弄丢了。C18枪头活化、平衡、上样、清洗、洗脱，洗脱用60% ACN/0.1% FA。真空浓缩到5 μL就停，别抽到全干，短肽会贴壁。
第二步：分维度系统排查
1. 裂解与变性不完全。现象：高丰度蛋白覆盖也低，膜蛋白几乎无肽。原理：复合物没打开，疏水区被包埋，胰酶接触不到。判断：SDS-PAGE看条带是否拖尾、上清是否澄清。验证：裂解前后测BCA，取5 μg跑胶。解决：裂解液用8 M尿素或1% SDC，加DTT 10 mM 56°C 30 min，IAA 20 mM室温避光30 min；超声3 s on/3 s off，20%功率，10个循环，冰上操作。若用SDS，换SP3或S-Trap，别直接进胰酶。
2. 酶切条件不达标。现象：漏切位点多，肽段偏长，覆盖低。原理：胰酶需要pH 8.0、尿素低于1.5 M、足够酶量。判断：搜库看漏切数和肽段长度分布，漏切>3个、长度>30 aa偏多就要怀疑。验证：BSA 1 μg加胰酶50 ng，37°C 16 h，覆盖应>70%。解决：50 mM NH4HCO3调pH 8.0；尿素稀释到<1.5 M，最好<1 M；加10% ACN可提升酶切；酶:蛋白=1:50，先37°C 4 h，再补1:100胰酶，继续12 h。别超过37°C，胰酶会自切。
3. 去污剂、盐、有机溶剂残留。现象：色谱峰变宽，柱压升高，鉴定数少。原理：SDS、Triton抑制胰酶，盐和PEG干扰电喷雾，离子抑制严重。判断：样品是否起泡、粘稠；查缓冲液配方。验证：取等量BSA，加入相同缓冲液酶切，看BSA覆盖是否也掉。解决：SDS控制在0.1%以下，Triton 0.01%以下；盐<50 mM；用SP3磁珠、S-Trap或C18脱盐。尿素样品酶切前至少稀释8倍。
4. 脱盐与上样损失。现象：肽段总量低，短肽和亲水肽流失。原理：C18对<5 aa肽段保留差，过度干燥导致吸附。判断：脱盐前后做荧光定量或LC-MS峰面积。验证：用iRT标准肽走一遍脱盐。解决：C18 200 μL枪头，100% ACN活化3次，0.1% FA平衡3次，上样后0.1% FA清洗3次，60% ACN/0.1% FA洗脱2次；真空浓缩至5 μL，立即加0.1% FA复溶；上样200-500 ng。
5. LC-MS/MS与采集参数。现象：肽段酶切不错，但谱图少、覆盖低。原理：梯度太短、DDA采样不足、柱效差、离子抑制。判断：看TIC峰容量、母离子强度、柱压。验证：跑HeLa digest或iRT标准品。解决：75 μm内径柱，流速300 nL/min，梯度60-120 min；DDA top20，NCE 27-30，动态排除20 s；若仍低，改用DIA或PRM验证关键肽。
6. 搜库参数不匹配。现象：FDR正常，覆盖却低。原理：漏切、固定修饰、前体容差设置错误，真肽被过滤。判断：看漏切数、半胱氨酸烷基化是否设为固定修饰。验证：换MaxQuant或Proteome Discoverer默认参数重搜。解决：酶设为Trypsin/P，允许2个漏切；固定Carbamidomethyl，可变Oxidation(M)、乙酰化N端；前体容差10 ppm，碎片0.02 Da；FDR 1%。酶切时间短时，增加漏切会提覆盖，但别设太多，否则假阳性涨。
第三步：进阶疑难问题
1. 过夜酶切反而覆盖低。现象：短肽增多，柱流失，鉴定数下降。原理：胰酶自切产生伪肽，竞争离子化。判断：看胰酶自切峰是否明显。解决：37°C 4 h后补1:100酶，继续12 h；或换Trypsin/Lys-C混合酶，37°C 16 h。验证：BSA对照应稳定>70%。
2. 修饰和交联导致漏切。现象：磷酸化、糖基化、泛素化肽段覆盖差。原理：修饰阻碍酶切，改变离子化效率。判断：搜库加可变修饰，看修饰肽比例。解决：Glu