来源：T4连接酶效率低摩尔比（DNA Lab Space 实验教程）| 编译：DNA Lab Space
连接做了一整天，转化板上一片白。心里凉半截。别急着换酶，大概率是摩尔比和体系细节出了问题。T4连接酶效率低，不是玄学。载体多少ng，插入片段多少ng，比例怎么算，buffer冻融几次，PEG加没加，温度时间对不对，每个环节都能让连接效率掉到谷底。本文按操作流程拆解，从低级错误到进阶疑难，给你能直接照做的排查路径和具体参数。照着走，今晚就能把板子长出来。
第一步：快速排查低级错误
1. 浓度测错。NanoDrop测DNA浓度受RNA和盐干扰，摩尔比直接算歪。解决：用Qubit荧光定量，A260/A280控制在1.8-2.0。
2. 把质量比当摩尔比。载体100 ng，插入也加100 ng，以为1:1，实际插入分子数多出好几倍。解决：用公式算，插入ng = 载体ng × (插入bp/载体bp) × 目标摩尔比。
3. 连接酶反复冻融。T4酶每次拿室温，活性掉一半。解决：分装10 µL/管，-20°C保存，用前冰上融化