来源：质谱基质效应强样品净化（DNA Lab Space 实验教程）| 编译：DNA Lab Space
同一支标样，纯溶剂里响应百万，一进血清就剩两成。回收率今天 95%，明天 60%。你换柱子、洗源、调离子对，折腾一周没进展。问题大概率不在质谱，在前处理。这篇按取样、沉淀、除脂、SPE、复溶、进样六段拆开，每段给判断标准、具体体积温度和时间，还有怎么验证。
第一步：快速排查四个低级错误
1. 内标加得晚。提取前加和复溶后加是两回事。内标必须在样品还完整时加，有机溶剂占比压到 5% 以内，比如 100 µL 血浆加 5 µL 内标。
2. 复溶液有机相太猛。80% 甲醇复溶直接进样，峰形劈叉，基质效应被放大。换成初始流动相比例，例如 5% 甲醇/水或 10% 乙腈，复溶体积 100–200 µL。
3. 反复冻融。−80°C 冻融超过 3 次，蛋白降解、结合态释放，响应就飘。取样后按 200 µL 分装，一次一管。
4. 进样小瓶污染。旧隔垫的增塑剂和瓶壁残留会抑制离子。换新瓶新垫，或者甲醇:水=1:1 超声 10 min 再用。
第二步：分维度系统排查
1. 取样与样品状态
现象：同批前几针正常，后面越来越低。血样没及时离心，红细胞还在；组织常温放太久，酶把目标物降解了。原理：目标物和蛋白结合或被代谢，浓度其实变了，你以为是基质效应。解决：全血 4°C、3000 g 离心 10 min 取血浆，30 min 内完成；组织取样后立刻液氮，−80°C 存。验证：测 0 时和 4 时的基质加标，差超 15% 就说明样品不稳定。
2. 蛋白沉淀
现象：进样几针后柱压缓升，目标峰拖尾，内标峰面积掉 30%。沉淀剂比例不够，上清里还有可溶蛋白，进柱后变性吸附。原理：蛋白在有机相里沉淀，乙腈:样品至少 3:1，甲醇至少 4:1。解决：血浆 100 µL 加 300 µL 含 0.1% 甲酸的乙腈，涡旋 30 s，−20°C 静置 20 min，14000 g、4°C 离心 15 min，取上清。验证：上清再离心一次，还有沉淀就是没沉干净；跑一针看柱压回不回落。
3. 除磷脂
现象：正离子模式下 m/z 184 通道一直高，目标物被抑制 40–70%。原理：磷脂酰胆碱在 C18 上保留强，还容易在源内形成加合物，抢电荷。解决：乙腈沉淀后用正己烷或 MTBE 萃取一次，上清氮吹；或用磷脂去除 96 孔板，按 1 mL 甲醇活化、1 mL 水平衡、上样、1 mL 5% 甲醇水淋洗、1 mL 甲醇洗脱走。验证：盯 m/z 184 的响应，比未除脂样品低 80% 以上算过关。
4. SPE 净化
现象：回收率忽高忽低，RSD 超 20%。原理：柱床干涸、上样太快，目标物穿漏或洗脱不全。解决：活化甲醇 1 mL，水平衡 1 mL，全程别抽干；上样 1 mL 控在 1 mL/min；淋洗 1 mL 5% 甲醇水后抽干