来源：哺乳细胞贴壁差基质包被（DNA Lab Space 实验教程）| 编译：DNA Lab Space
昨天还贴得稳稳的细胞，今天换皿就飘？别急着怪血清或污染。贴壁差大概率出在基质包被：选错胶、浓度太低、孵育不够、板子变干、洗得太狠。本文按实验流程拆开排查。从低级错误到包被参数、接种窗口、原代/干细胞疑难，给你能直接照做的体积、温度、时间和验证方法。
第一步：快速排查低级错误
1. 板子不是TC-treated？ 普通细菌皿表面疏水，细胞很难铺展；换成TC-treated板或确认已包被。
2. 包被液没盖满孔底？ 孔中央有胶、边缘没胶，细胞会往中间挤；按6孔板1 mL/孔、96孔板50-100 μL/孔加液，轻晃铺满。
3. 包被后板子放干了？ 蛋白基质一干燥就变性；包被后别开盖风干，洗涤后立刻接种或加PBS封存。
4. 消化过头或吹打过猛？ 细胞表面受体被胰酶切掉，吹成单细胞时机械损伤；用0.05%胰酶-EDTA，37°C消化1-3分钟，见细胞回缩就终止。
第二步：分维度系统排查
2.1 基质选型：你包的可能不是它要的胶
现象：同一株细胞，别人包被贴得好，你包被仍飘。
原理：不同细胞依赖不同ECM受体。上皮/内皮偏层粘连蛋白，间充质/成纤维偏纤连蛋白或胶原。
解决：
- 纤连蛋白：5-10 μg/mL，PBS稀释，37°C 1小时或室温2小时。
- 胶原I：50-100 μg/mL，37°C 1小时或4°C过夜。
- 层粘连蛋白：5-10 μg/mL，37°C 1小时。
- 多聚赖氨酸：0.01%溶液，室温30-60分钟，用PBS洗3次。
- Matrigel：冰上1:30-1:100稀释，37°C 30-60分钟。
验证：用0.1%结晶紫染包被孔，洗后拍照，看孔底是否均匀着色。
2.2 包被操作：浓度、时间、洗涤三件事
现象：孔底看着有液，接种后细胞成团漂。
原理：蛋白未吸附够，或洗涤把盐和未结合蛋白冲不净，影响细胞接触。
解决：包被液必须新鲜配，用PBS或无血清DMEM稀释。37°C孵育1小时，或4°C过夜。吸掉液体后，PBS洗2次，每次1 mL/孔。需要封闭时，用1% BSA-PBS室温30分钟，再洗1次。
验证：包被后加无血清培养基，37°C放30分钟，看是否有蛋白脱落浑浊。
2.3 细胞接种：密度、血清、动手方式
现象：4小时贴壁率低于50%，24小时仍有大量圆细胞。
原理：密度太低，细胞分泌的ECM不足；无血清时整合素激活差；吹打产生碎片。
解决：贴壁细胞系接1-5×10^4/cm²，原代细胞接1-5×10^5/mL。离心200×g，5分钟。用含10% FBS的完全培养基重悬。接种后37°C、5% CO2静置12-24小时，别频繁开盖。
验证：接种后2小时、6小时、24小时各拍一次相差照片，计数贴壁细胞比例。
2.4 环境和基质保存：温度、pH、蒸发
现象：边缘孔细胞飘，中间孔正常。
原理：边缘孔蒸发快，培养基pH升到7.8以上，整合素失活。
解决：边缘孔加PBS或培养基。培养基pH保持7.2-7.4，CO2设5%。包被板密封后4°C可放1-2周，Matrigel板别反复冻融。
验证：看酚红颜色，发紫说明偏碱；换新板复测。
第三步：进阶疑难问题
1. 原代细胞/干细胞贴壁差：普通纤连蛋白不够。换成层粘连蛋白10 μg/mL或Matrigel 1:20，37°C包被1小时。接种密度提到5×10^5/mL，前24小时别换液。
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