来源：毛细管等电聚焦聚焦差两性电解质（DNA Lab Space 实验教程）| 编译：DNA Lab Space
跑cIEF，最怕的不是没峰，是峰像被擀面杖压过：宽、矮、拖尾，pI标记也聚不拢。你换柱子、加电压、调pH，折腾一下午，结果还是糊。问题大概率不在仪器，而在两性电解质、样品基质和聚焦条件这三块。下面按“低级错误→系统排查→进阶疑难”三步走，把毛细管等电聚焦聚焦差的常见坑一次拆完。
第一步：快速排查低级错误
1. 两性电解质加错量或漏加。现象是pI标记都聚不锐，峰宽得离谱。直接看配方，常用2%–4% (v/v)，别只加0.1%。
2. 样品盐浓度太高。现象是电流飙、峰位漂。用10 kDa超滤管换液3次，或透析2 h，让盐低于20–50 mM。
3. 毛细管没清洗或涂层老化。现象是迁移时间逐针变短、拖尾。每天先用0.1 M HCl冲5 min，水2 min，0.1 M NaOH冲5 min，水2 min。
4. 电压程序设错。现象是样品没聚焦就 mobilization。预聚焦15 kV 3 min，聚焦20–25 kV 15–30 min，别一上来就25 kV。
第二步：分维度系统排查
1. 样品前处理模块
原因1：盐和缓冲液组分干扰。
现象：聚焦时电流高、峰位漂，pI标记也偏。
原理：盐离子迁移率高，抢电流，破坏pH梯度；高盐还产热，让梯度塌。
解决：用0.5–2 mL超滤管换液3次，最终盐<20 mM；蛋白浓度0.1–1 mg/mL。含尿素样品用4–8 M尿素，DTT 10–50 mM，别加SDS。
验证：测电导，电导<1 mS/cm再进样；先只跑pI marker看聚焦。
原因2：蛋白在pI附近沉淀。
现象：峰突然消失，或出现尖刺，毛细管堵。
原理：蛋白在等电点溶解度最低，高浓度直接析出。
解决：稀释到0.1–0.5 mg/mL，加0.1%–0.5% methylcellulose或0.05% Tween-20，4°C操作。
验证：离心14000×g 10 min，看有无沉淀；换低浓度重跑。
2. 两性电解质与载体模块
原因1：两性电解质浓度或pH范围不对。