来源：蛋白表达可溶差分子伴侣共表达（DNA Lab Space 实验教程）| 编译：DNA Lab Space
你兴冲冲跑了SDS-PAGE，结果上清空荡荡，沉淀条带粗得刺眼。换了低温、降了IPTG，还是包涵体。于是你共表达了分子伴侣——GroEL/GroES、DnaK/DnaJ/GrpE都试了，可溶条带依然没影。问题出在哪？这篇教程按实验流程拆成7步，从低级错误到进阶疑难，给你一份能直接上手操作的排查清单。别急着扔质粒，大概率只是某个参数没配平。
第一步：快速排查低级错误
共表达不溶，先别怪分子伴侣没用。下面4个坑，新手踩得最多。
1. 双质粒抗性没配平。表达质粒是卡那抗性，分子伴侣质粒是氯霉素抗性，你只加了卡那。质粒丢失是必然的。解决：双抗LB，氯霉素34 µg/mL，卡那50 µg/mL。
2. 忘了加阿拉伯糖，或者加了葡萄糖。pGro7、pKJE7用araBAD启动子，没阿拉伯糖分子伴侣根本不表达。葡萄糖会抑制这个启动子。解决：诱导时加L-阿拉伯糖至1-2 mg/mL，培养基别用葡萄糖，用甘油。
3. 诱导温度死守37°C。37°C下翻译速度太快，折叠根本跟不上。解决：直接降到16-25°C，别犹豫。
4. IPTG浓度过高。1 mM IPTG在共表达体系里太猛，包涵体概率飙升。解决：起始浓度0.1-0.3 mM，做梯度。
第二步：分维度系统排查
1. 共表达系统兼容性检查
现象：双抗平板长菌，但诱导后SDS-PAGE上两个蛋白条带都弱，或者只看到分子伴侣，靶蛋白消失。
原理：两个质粒复制子相同会不相容。pET系列常用ColE1，分子伴侣质粒pGro7、pKJE7用p15A，理论上兼容。但如果你用的表达质粒也是p15A，质粒会随机丢失。抗性标记失效也会导致只长菌不表达。
解决步骤：
- 确认表达质粒复制子。pET是ColE1，pBAD是pBR322，pACYC是p15A。别搞混。
- 重新转化：取1 µL两种质粒（各约50 ng）加入50 µL BL21(DE3)感受态，冰浴30 min，42°C热击45 s，加500 µL LB，37°C复苏45 min，涂双抗平板。
- 挑单菌落，接5 mL双抗LB，37°C 200 rpm过夜。保甘油管，-80°C。
验证方法：从过夜菌提双质粒，做双酶切，跑0.8%琼脂糖凝胶，看两条带大小对不对。或者用质粒特异性引物做PCR。
2. 分子伴侣诱导时机与强度
现象：分子伴侣条带很浓，靶蛋白上清依然少，甚至总表达量下降。
原理：分子伴侣过量会抢夺折叠中间体，也可能造成代谢负担，抑制靶蛋白转录翻译。GroEL/GroES和DnaK/DnaJ/GrpE的化学计量比不对时，反而帮倒忙。
解决步骤：
- 先诱导分子伴侣30 min，再加IPTG。具体：OD600到0.4时加阿拉伯糖1 mg/mL，37°C摇30 min；OD600到0.6时加IPTG 0.1 mM，转16°C。
- 降低阿拉伯糖至0.5 mg/mL。别用2 mg/mL，过高。
- 如果还不行，换弱启动子分子伴侣质粒，比如pTf16（Tig），或者用低拷贝载体。
验证方法：诱导后每小时取1 mL菌液，离心收菌，加100 µL 1×SDS上样缓冲液，煮沸10 min，跑12% SDS-PAGE。看分子伴侣和靶蛋白条带随时间的变化。
3. 诱导条件没优化，直接上伴侣是浪费
现象：沉淀条带极粗，上清几乎为零。换伴侣组合也没改善。
原理：低温、低IPTG、延长诱导时间，这三招能让翻译速率匹配折叠速率。很多靶蛋白根本不需要伴侣，只需要慢下来。
解决步骤：
- 小量筛选：5 mL LB，OD600 0.6，IPTG梯度0.05、0.1、0.2、0.5 mM。
- 温度梯度：16°C 20 h，25°C 8 h，30°C 4 h。200 rpm。
- 培养基换成TB，或者加0.5 M山梨醇提升渗透压。
- 破碎：超声30%功率，3 s开3 s关，10 min。12000 rpm离心10 min，上清和沉淀分别留样。
验证方法：上清和沉淀各取20 µL跑胶。用ImageJ定量可溶比例。可溶比例低于10%就别死磕共表达了，先做条件优化。
4. 分子伴侣组合选错，等于白加
现象：pGro7共表达无效，pKJE7有效。或者反过来。
原理：GroEL/GroES管一般性折叠，DnaK/DnaJ/GrpE管新生肽链，Tig有肽基脯氨酰异构酶活性。你的靶蛋白需要哪种，只有试了才知道。
解决步骤：
- 备齐4种质粒：pGro7（GroEL/GroES）、pKJE7（DnaK/DnaJ/GrpE）、pG-Tf2（GroEL/GroES/Tig）、pTf16（Tig）。
- 每种单独转化，做5 mL小量诱导，条件统一：0.1 mM IPTG，16°C 20 h。
- 跑胶比较上清/沉淀比。
验证方法：可溶比例提升2倍以上才算有效。没效果就换下一个。
5. 宿主菌背景别忽略
现象：BL21(DE3)里不溶，换Rosetta(DE3)也没用。
原理：BL21(DE3)是lon/ompT缺陷，但缺少某些稀有密码子tRNA。Rosetta补充密码子，SHuffle改善二硫键。伴侣共表达时，宿主菌本身可能已经带了某些伴侣。
解决步骤：
- 先确认靶蛋白有无稀有密码子。有就用Rosetta(DE3)。
- 无稀有密码子就用BL21(DE3)。
- 含二硫键直接上SHuffle T7，30°C，0.1 mM IPTG，16 h。
验证方法：用同一质粒分别转化三种菌，平行诱导，跑胶。
第三步：进阶疑难问题
情况1：共表达后靶蛋白被降解，上清出现多条低分子量带。
DnaK/DnaJ/GrpE