来源：无细胞蛋白合成产量低能量（DNA Lab Space 实验教程）| 编译：DNA Lab Space
做CFPS最怕什么？模板加了，提取物换了，GFP对照明明亮，你的目的蛋白就是不出量。别急着怀疑核糖体。多数时候，问题卡在ATP/GTP供给、再生系统、Mg²⁺和副产物上。本文从新手低级错误到能量模块、连续交换系统，给你一条能直接动手的排查路径。
第一步：快速排查低级错误
1. 模板加太多。 质粒超过100 ng/µL时，转录和翻译短时间猛耗ATP，1小时后直接停。解决：质粒降到10–50 ng/µL，PCR产物用5–20 nM，先做2倍梯度。
2. NTP/能量mix反复冻融。 冻融3次以上，GTP和CP降解，批间波动大。解决：10 µL分装，-80°C保存，冰上融化，室温别放超过30分钟。
3. 孵育温度照抄37°C。 E. coli S30常用37°C，但某些提取物37°C下ATP酶更活跃。解决：先试30°C、4小时、200 rpm，和37°C并排比。
4. 提取物批次已经失活。 旧批次内源ATP低，翻译因子也掉。解决：每批S30用pET-GFP做阳性对照，比活性低于新批次70%就别用。
第二步：分维度系统排查
1. 提取物内源能量与ATP酶
现象： 0–30分钟产量上升，1小时后平台或下降。
原理： S30里残留ATP酶、蛋白酶。内源ATP只有0.5–1 mM，10分钟就能耗尽。
解决： 新鲜制备S30。菌体长到OD600 0.6–0.8，诱导后收菌，洗涤，高压破碎，30,000 g、4°C离心30分钟。加1 mM DTT，-80°C保存，3个月内用完。
验证： 反应里补1.2 mM ATP，若产量明显回升，说明提取物能量不足或ATP酶高。