来源：代谢工程副产物多敲除靶点（DNA Lab Space 实验教程）| 编译：DNA Lab Space
做代谢工程，最烦的不是没产量，而是副产物像打地鼠：敲了ldhA，乙酸上来；补敲pta-ackA，乙醇又冒头。多靶点叠加后，电转没菌、平板上全是假阳性、PCR条带忽大忽小。别急着怀疑菌株。这篇按转化、筛选、验证、代谢流四段，把多敲除失败原因拆开。覆盖E. coli和酵母常见多靶点，给出具体温度、浓度、时间，照着做能少走两周弯路。
第一步：快速排查低级错误
1. 抗生素平板失效：氨苄青霉素板放4°C超过1个月，转化后克隆少或背景杂。重新配100 µg/mL Amp，现配现用。
2. 感受态效率低：DH5α电转效率应≥10^8 cfu/µg。若每次<10^6，别硬做多敲除，重制感受态或换电转杯。
3. 菌液/质粒交叉污染：多靶点常用多个sgRNA质粒，移液枪或管盖沾到野生型。换滤芯枪头，每管独立开盖。
4. 培养条件不对：E. coli 37°C 220 rpm；酵母30°C 200 rpm。诱导Cas9若用30°C过夜，别直接37°C猛摇。
第二步：分维度系统排查
A. 靶点与sgRNA设计
1. 靶点冗余/旁路未断
现象：单敲ldhA后乳酸降了，但乙酸、乙醇、琥珀酸仍高，OD600正常。
原理：代谢网络有替代路径，丙酮酸节点会流向PoxB、PflB、AdhE等。
解决：先画节点。E. coli敲副产物常用组合：ΔldhA ΔpoxB Δpta-ackA，乙醇路径ΔadhE，琥珀酸路径ΔfrdABCD，甲酸路径ΔfocA-pflB。别一次上6个，先做2-3个验证。
验证：HPLC测胞外代谢物，葡萄糖、乙酸、乳酸、乙醇、琥珀酸。副产物摩尔得率降50%以上再叠下一轮。
2. sgRNA活性差或脱靶
现象：转化有菌，但靶点PCR仍为野生型条带，或测序见嵌合峰。
原理：sgRNA二级结构、PAM附近GC过高、Cas9切割效率低，都会让编辑失败。
解决：每条sgRNA选PAM前20 nt，GC 40-60%，避开连续T。用在线工具打分，选2条并行。电转Cas9-sgRNA质粒500 ng，37°C复苏1 h后涂板。
验证：colony PCR跨靶点，野生型条带消失或变小；Sanger测序确认缺失/移码。
B. Donor DNA与同源重组
3. 同源臂太短或供体不足
现象：切割有，但敲不掉；平板上长出的都是未编辑或随机整合。
原理：多敲除依赖HDR，同源臂短于500 bp时重组率断崖下降。
解决：供体用线性dsDNA，同源臂每侧500-1000 bp，浓度100 ng/µL，电转1-2 µg。若做点突变/短缺失，可单链寡核苷酸60-90 nt，但多基因缺失优先dsDNA