流加培养代谢副产物积累补料优化

来源：流加培养代谢副产物积累补料优化（DNA Lab Space 实验教程）| 编译：DNA Lab Space

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补料流加跑了一夜，早上取样一看：OD不涨了，上清乙酸5 g/L，乳酸2 g/L，产物表达掉一半。你调了补料速率，没用。大概率不是单一原因。下面按操作链条拆：从低级错误到进阶疑难，覆盖大肠杆菌、毕赤酵母和CHO的常见副产物场景。每步给判断动作、验证方法和具体参数。直接照着做。

第一步：快速排查低级错误

• 补料葡萄糖灭菌后pH偏酸：115°C 20 min，葡萄糖焦化产酸，pH掉到5.5。解决：糖单独0.22 μm过滤，或115°C 15 min。
• 蠕动泵没标定：设定5 mL/min，实际12 mL/min。解决：称重法标定，泵管每24 h换位置。
• DO电极没校准：显示60%，实际接近零。解决：灭菌前两点校准，灭菌后零点验证。
• pH探头漂移：设7.0，实际6.2。解决：标准液4.01/7.00两点校准，离线pH比对。

第二步：分维度系统排查

1. 种子活力和接种量

现象：迟滞期超过4 h，早期乙酸就>1.5 g/L。原理：接种量低，细胞被迫拉高比生长速率μ，糖酵解通量超过TCA循环容量，乙酰CoA溢流成乙酸。解决：接种OD600到0.1-0.2，种子OD 4-6、活力>90%。别用过夜死种子。验证：摇瓶测种子μ，对比不同接种量。

2. 初始碳源浓度

现象：批次阶段乙酸冲到2-3 g/L，葡萄糖还剩5 g/L。原理：葡萄糖过量，糖酵解速度超过丙酮酸脱氢酶和TCA通量，溢流代谢开启。解决：初始葡萄糖5-10 g/L（E. coli），或甘油10 g/L。毕赤酵母用甘油20 g/L。验证：每1 h取上清，H