来源：昆虫细胞杆状病毒滴度低感染复数（DNA Lab Space 实验教程）| 编译：DNA Lab Space
做Sf9杆状病毒，最崩的是：转染后P1看着还行，P2滴度却只有1×10⁶ IFU/mL，按MOI=5感染，细胞48小时不死，蛋白也不表达。别急着扔病毒。滴度低和MOI算错，往往不是单一问题。本文按转染、扩增、滴度测定、感染四段查，给具体体积、时间、温度，也讲进阶污染和缺陷颗粒。
第一步：快速排查低级错误
1. 细胞代次太高、密度太密。Sf9超过30代，或传代密度冲到4×10⁶/mL，病毒产量直接掉。解决：每2-3个月复苏新管，传代维持0.5-1×10⁶/mL，活率>95%。
2. 转染时细胞密度不对。6孔板铺9×10⁵/孔，贴壁1小时，转染时汇合度60-70%。解决：按Bac-to-Bac手册，1 µg bacmid + 8 µL Cellfectin II，27°C孵育5小时换液。
3. 病毒上清没离心、没过滤。碎片堵枪头，滴度测出来假低。解决：1500g离心10分钟，0.45 µm滤膜过滤，4°C避光保存。
4. MOI用qPCR值直接算。qPCR测基因组，空壳也算，MOI会虚高10-100倍。解决：先用TCID50测感染性滴度，扩增MOI 0.05-0.1，表达MOI 1-10。
第二步：分维度系统排查
1. 转染效率低，P1先天不足。
现象：转染后72小时细胞不肿胀、不脱落，P1滴度<1×10⁵ IFU/mL。
原理：bacmid进核效率决定早期复制，脂质体用量、DNA纯度、细胞状态缺一不可。
解决：取对数期Sf9，活率>97%，6孔板每孔1×10⁶ cells，27°C贴壁1小时。A管：1 µg bacmid + 100 µL Grace's无血清；B管：8 µL Cellfectin II + 100 µL Grace's。室温静置15分钟，混合再静置15分钟，补800 µL无血清培养基，覆盖细胞，27°C孵育5小时。弃液，换2 mL含10% FBS的Grace's，27°C培养72-96小时。第3天起每天看，细胞膨胀、颗粒增多、开始脱落就收P1。
验证：收上清做TCID50，P1应≥1×10⁶ IFU/mL。低于1×10⁵，重转染，别往下传。
2. P1扩增时MOI和细胞密度不匹配。
现象：P2滴度只有1×10⁶ IFU/mL，甚至比P1低。
原理：MOI<0.01，病毒要多轮复制，产量低；MOI>1，细胞早死，病毒没释放完。密度>3×10⁶/mL，营养先耗尽。
解决：P1按MOI 0.05-0.1感染Sf9，细胞密度1.5-2×10⁶/mL，27°C、110-130 rpm。培养48-72小时，活率降到70-80%或细胞直径增大20%，立刻1500g离心10分钟收上清。别死等72小时。
验证：P2 TCID50应比P1高0.5-1 log，达1×10⁷-1×10⁸ IFU/mL。若qPCR测vg/mL，vg:IFU最好<100，否则空壳多。
3. 滴度测定方法本身偏。
现象：同一批病毒TCID50是1×10⁷，qPCR是1×10⁹，感染实验却做不出来。
原理：TCID50测感染性，qPCR测基因组。缺陷颗粒、空壳都算qPCR，不能直接换算MOI。
解决：固定感染性滴度法。Sf9铺96孔，每孔5×10⁴ cells/100 µL，27°C贴壁1小时。病毒