来源：Synthetic CO2-fixation pathway empowers Yarrowia lipolytica for high-performance succinic acid biosynthesis（Synthetic and Systems Biotechnology）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
琥珀酸是重要的C4平台化合物，但好氧解脂耶氏酵母经氧化TCA途径合成琥珀酸时碳损失严重。本研究在解脂耶氏酵母中异源构建磷酸核酮糖激酶（Prk）—核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶（RuBisCo）CO₂固定通路，借助大肠杆菌GroEL/S伴侣蛋白促进RuBisCo折叠，并通过多拷贝表达提升CO₂回收效率。摇瓶中琥珀酸滴度提高8%、得率提高32%；5 L生物反应器不控pH条件下滴度达124.61 g/L，甘油转化率0.46 g/g，生产强度0.88 g/(L·h)。这是该通路在解脂耶氏酵母中的首次功能建立。
研究背景
琥珀酸属C4二羧酸家族，是生物基化学品制造中的关键平台分子，传统应用覆盖可降解塑料、食品酸味剂与表面活性剂等领域。两个羧基赋予其高化学可塑性：催化加氢可得1,4-丁二醇，后者可进一步加工为四氢呋喃、γ-丁内酯和2-吡咯烷酮。凭借强衍生化潜力与环境友好属性，美国能源部将琥珀酸列为十二种优先生物基平台化学品之一。以发酵法替代石油基合成因此成为生物制造领域的重要方向。
目前发酵法生产琥珀酸主要依赖细菌与酵母平台。相较细菌，酵母耐酸性更强，在低pH下仍能维持稳定生长与代谢活性。但问题在于，好氧解脂耶氏酵母中经氧化TCA（oTCA）途径生成琥珀酸伴随大量碳损失——甘油高度还原，过量胞内NADH/NADPH驱动甘露醇与赤藓醇等多元醇副产物积累，拉低底物转化率与经济性。如何在好氧条件下"回收"CO₂、平衡氧化还原，成为提升得率的关键切入点。本研究把目光投向自养生物固定CO₂的核心模块——CBB循环中的Prk-RuBisCo通路。
研究方法
2.1 菌株与培养条件
本研究所用工程菌株汇总于表1。出发菌株为ST-109（Y. lipolytica Po1f-Δku70, ΔA08::LEU, Δsdh5, Δach1, ΔintF::YlPYC, Δpck, ΔIntC1::YlICL, YlMLS），它是解脂耶氏酵母Po1f（ATCC MYA-2613）的琥珀酸生产衍生株，其中KU70已被敲除以提高同源重组（HR）效率[14]。解脂耶氏酵母菌株在酵母蛋白胨甘油（YPG）培养基中、30°C、200 rpm orbital 振荡条件下培养约24 h，用于转化与发酵。大肠杆菌细胞在含氨苄青霉素的Luria-Bertani（LB）肉汤中培养，37°C、200 rpm振荡培养14至16 h以进行质粒提取。固体培养基通过在相应液体培养基中加入2%琼脂制备。工程菌株转化子在缺乏尿嘧啶并补充2%甘油的合成完全固体培养基（SC-Ura-G）上筛选[26]。URA3-blaster系统中的URA3标记使用YPD+5-FOA固体培养基回收。YPG、含氨苄青霉素LB、SC-Ura及YPD+5-FOA固体培养基的详细配方与制备流程均按既往报道执行[27]。
【数据】菌株：ST-109（Po1f-Δku70, ΔA08::LEU, Δsdh5, Δach1, ΔintF::YlPYC, Δpck, ΔIntC1::YlICL, YlMLS）；培养基：YPG、LB+氨苄青霉素、SC-Ura-G、YPD+5-FOA；温度：酵母30°C、大肠杆菌37°C；转速：200 rpm；时间：酵母约24 h、大肠杆菌14–16 h；琼脂：2%；甘油：2%
2.2 质粒构建
本研究所构建的所有重组质粒均衍生自pUC57骨架，以URA3为选择标记。每个载体质粒含pUC57骨架、目标位点的上游同源臂、HisG-URA3-HisG（HUH）盒以及下游同源臂。基因表达用重组质粒的构建方式为：将表达盒插入同源臂与HUH片段之间，采用一步克隆法，方法如先前所述[28]。所构建的整合质粒如下：pUC-HUH-IntC3-TdCBBM，用于表达Thiobacillus denitrificans TdCBBM（AAA99178.2）[29]；pUC-HUH-SCP2-SoPRK，用于表达Spinacia oleracea SoPRK（110791203）[16]；pUC-HUH-7h-YlHSP10-YlHSP60，用于表达伴侣蛋白基因YlHSP10（YALI1B07652g）与YlHSP60（YALI1F04045g）；pUC-HUH-7h-EcGROES-EcGROEL，用于表达大肠杆菌伴侣蛋白基因EcGROES（948655）与EcGROEL（948665）[30]；以及多拷贝质粒pUC-HUH-IntD-TdCBBM-EcGROES-EcGROEL。所需启动子、目标基因与终止子均通过PCR扩增从解脂耶氏酵母Po1f基因组中获取。另外，密码子优化的异源基因由江苏科为生物科技有限公司合成订购。质粒pUC-HUH-IntC3-TdCBBM的构建方式为：PCR扩增启动子PTEFin、基因TdCBBM与终止子TPEX10，随后将这些纯化片段用一步克隆法插入pUC-HUH-IntC3质粒。其余单基因表达盒均采用相同方法构建。对于含两个及以上表达盒的质粒，先组装各表达盒，再连同额外整合片段或表达盒用一步克隆法整合入载体。本工作涉及的质粒、引物与外源基因均收录于补充数据表S1–S3。
【数据】质粒骨架：pUC57；选择标记：URA3；整合盒：HisG-URA3-HisG（HUH）；外源基因：TdCBBM（AAA99178.2）、SoPRK（110791203）、YlHSP10（YALI1B07652g）、YlHSP60（YALI1F04045g）、EcGROES（948655）、EcGROEL（948665）；启动子：PTEFin；终止子：TPEX10；方法：一步克隆；原文未详述PCR退火温度与循环参数
2.3 菌株转化
质粒pUC-HUH-IntC3-TdCBBM、pUC-HUH-SCP2-SoPRK、pUC-HUH-7h-YlHSP10-YlHSP60、pUC-HUH-7h-EcGROES-EcGROEL与pUC-HUH-IntD-TdCBBM-EcGROES-EcGROEL经线性化后，使用Frozen-EZ Yeast Transformation II试剂盒整合入尿嘧啶营养缺陷型工程菌株ST-109，获得表1所列衍生工程菌株。转化子涂布于SC-Ura-G固体培养基，正确转化子经PCR确认。对于后续轮次的基因整合，将在5 mL YPG培养基中过夜培养的菌液划线于YPD+5-FOA固体培养基，培养2至3天。随后挑取单菌落，点种至SC-Ura-G与YPD+5-FOA两种固体培养基上。培养2至3天后，在SC-Ura-G上不生长而在YPD+5-FOA上生长的菌落经裂解并进行PCR验证。URA3选择标记的成功去除表现为PCR产物缩短约3000 bp，对应URA3表达盒及一个HisG片段的缺失。
【数据】菌株：ST-109（ura3营养缺陷型）；试剂盒：Frozen-EZ Yeast Transformation II；筛选培养基：SC-Ura-G、YPD+5-FOA；过夜培养体积：5 mL YPG；培养时间：2–3天；PCR验证：标记去除后产物缩短约3000 bp；原文未详述转化DNA用量与热激条件
2.4 发酵实验
摇瓶发酵始于将单菌落（从YPG固体平板挑取）接种至5 mL YPG培养基，30°C、200 rpm振荡培养24 h。随后将该预培养物转接至摇瓶中50 mL发酵培养基，初始OD600为0.1。主发酵在30°C、200 rpm orbital 振荡下进行120 h。
【数据】种子液体积：5 mL YPG；种子培养：30°C、200 rpm、24 h；发酵体积：50 mL；初始OD600：0.1；发酵条件：30°C、200 rpm、120 h
2.5 生物反应器发酵
为评估CO₂回收重组菌株ST-206的琥珀酸合成能力，发酵装置转移至5 L罐体。将携带菌株ST-206的过夜培养物接入盛有50 mL YPG肉汤的250 mL Erlenmeyer三角瓶，培养24 h，随后二次转接至盛有100 mL相同预培养液的500 mL摇瓶，再培养36 h。生物反应器初始装液2 L培养基，组成为150 g/L甘油、20 g/L蛋白胨与10 g/L酵母提取物。当甘油水平降至10 g/L以下时，以3–10 mL/h速率连续补加900 g/L甘油溶液。培养温度维持28°C，通气速率恒定为2 v.v.m.，不进行pH调控。20%溶解氧（DO）设定点仅通过调节300–800 rpm范围内的搅拌转速实现。
【数据】菌株：ST-206；罐体：5 L；装液量：2 L；培养基：150 g/L甘油、20 g/L蛋白胨、10 g/L酵母提取物；补料：900 g/L甘油，3–10 mL/h，触发阈值10 g/L；温度：28°C；通气：2 v.v.m.；pH：不调控；DO：20%，搅拌300–800 rpm；预培养：50 mL/24 h + 100 mL/36 h
2.6 代谢物分析
发酵结束后，取1 mL培养液于13,000 rpm离心3 min。弃去上清，将细胞沉淀重悬于去离子水中，使OD600值处于0.2至4之间。稀释后细胞悬液的OD600用Synergy H1多功能微孔板读数仪测定，最终OD600由测定值乘以稀释倍数计算。目标产物琥珀酸及副产物赤藓醇、草酰乙酸、苹果酸与甘露醇在胞内合成后分泌至胞外培养基中。这些代谢物连同作为碳底物的甘油，在配备示差检测器与Aminex HPX-87H色谱柱的1260 Infinity II Prime液相色谱平台上定量。测定前，各样品经0.22 μm水相滤膜过滤以去除悬浮颗粒。分析以5 mM H₂SO₄为流动相，流速0.6 mL/min，色谱柱恒温65°C[31]。
【数据】取样：1 mL；离心：13,000 rpm、3 min；OD600检测：Synergy H1，稀释范围0.2–4；色谱柱：Aminex HPX-87H；流动相：5 mM H₂SO₄；流速：0.6 mL/min；柱温：65°C；滤膜：0.22 μm；检测器：示差检测器
研究结果
3.1 甘油培养下Prk与RuBisCo对解脂耶氏酵母的代谢影响
在前期工作中，我们开发了一株能够合成琥珀酸的解脂耶氏酵母基因工程菌株。以甘油为底物在摇瓶中培养时，该菌株产生9.07 g/L琥珀酸，对应得率0.19 g/g。然而发酵液分析显示存在多种副产物，即0.22 g/L赤藓醇、1.29 g/L草酰乙酸、2.32 g/L苹果酸与4.04 g/L甘露醇[14]。在野生型解脂耶氏酵母中，低pH条件下以甘油培养有利于胞内多元醇（如甘露醇与赤藓醇）的积累。该效应归因于甘油较高的还原度，过量胞内NADH或NADPH促进甘露醇与赤藓醇的形成[32]。在解脂耶氏酵母以甘油为底物生产琥珀酸的过程中，甘露醇与赤藓醇的形成降低了底物转化效率与经济可行性。基于酿酒酵母中利用Prk-RuBisCo通路回收CO₂生产乙醇所建立的策略，我们将异源Prk-RuBisCo通路整合入工程菌株ST-109，旨在抑制副产物积累并由此提升琥珀酸得率。
Prk-RuBisCo通路是CBB循环的一部分，后者是绝大多数自养生物固定CO₂与合成糖类的中心代谢路线[33]。该通路中，核心CO₂固定生物催化剂是RuBisCo，该蛋白存在四种不同形式。仅Form I与Form II RuBisCo具备催化RuBP羧化或加氧反应的活性。Form I RuBisCo须组装为由八个大亚基与八个小亚基构成的16聚体结构才具催化活性，而Form II RuBisCo仅需由两个或六个大亚基组成的复合物即可表现酶功能[13]。在酿酒酵母中，基于Form I与Form II RuBisCo的Prk-RuBisCo通路均已被功能性构建，可实现CO₂回收用于乙醇生产[16,34]。由于Form II RuBisCo所需亚基更少，更适于异源表达与组装。因此选择编码来自Thiobacillus denitrificans的Form II RuBisCo的基因TdCBBM，在解脂耶氏酵母中构建异源Prk-RuBisCo通路（图2a）。
在菌株ST-109中异源表达密码子优化的TdCBBM获得工程菌株ST-201。该菌株的OD600、琥珀酸滴度与得率分别从7.82、9.07 g/L与0.19 g/g降至7.08、7.64 g/L与0.18 g/g（图2b、c、2d）。在酿酒酵母中，仅表达RuBisCo编码基因同样降低生物量，尽管乙醇产量未受影响[16]。Prk是该通路中另一必需组分，其功能是将经HMP途径氧化臂生成的Ru5P转化为RuBP。该酶虽可在酵母中有效表达，但单独表达PRK及由此产生的RuBP积累对宿主细胞有毒。具体而言，过量磷酸化糖的积累触发ROS（活性氧）生成，进而诱导胞内氧化应激（图2a）。由于酵母不能内源合成RuBP，选择来自Spinacia oleracea的PRK评估其在解脂耶氏酵母中的表达。与既往报道一致，表达SoPRK的工程菌株ST-202表现出严重生长抑制[35]。与出发菌株24 h时OD600达4.95相比，菌株ST-202同一时间点OD600仅为2.64，发酵结束最终OD600为5.37（图2b与c）。此外，菌株ST-202的琥珀酸滴度与得率显著降至6.13 g/L与0.16 g/g（图2b与d）。这些结果表明SoPRK在解脂耶氏酵母中实现了功能性表达。
【数据】出发菌株ST-109：OD600 7.82、琥珀酸9.07 g/L、得率0.19 g/g；副产物：赤藓醇0.22 g/L、草酰乙酸1.29 g/L、苹果酸2.32 g/L、甘露醇4.04 g/L；ST-201：OD600 7.08、7.64 g/L、0.18 g/g；ST-202：24 h OD600 2.64（对照4.95）、最终OD600 5.37、6.13 g/L、0.16 g/g
3.2 异源Prk-RuBisCo通路的功能性组装
为实现异源Prk-RuBisCo通路的功能性组装，将TdCBBM整合入菌株ST-202获得工程菌株ST-203，并评估其发酵性能（图3a）。菌株ST-203的OD600在24 h达3.70，较菌株ST-202提高40.15%。发酵后期观察到OD600略有下降，发酵结束时的最终OD600与菌株ST-202无显著差异（图3b与c）。仅携带TdCBBM与SoPRK的菌株ST-203将琥珀酸滴度恢复至与亲本菌株ST-109相当的水平，达8.93 g/L。得率亦从0.19 g/g略升至0.21 g/g（图3b与d）。这些表明异源Prk-RuBisCo通路可在解脂耶氏酵母中功能性实现，而无需表达伴侣蛋白。类似地，在K. marxianus中，异源Prk-RuBisCo通路已在未表达伴侣蛋白基因的情况下完成功能性组装，相对野生型获得更高的乙醇生成效率[23]。
【数据】菌株：ST-203（ST-202 + TdCBBM）；24 h OD600：3.70（较ST-202提高40.15%）；琥珀酸滴度：8.93 g/L；得率：0.21 g/g（ST-109为0.19 g/g）
3.3 伴侣蛋白辅助增强RuBisCo折叠
既往在酿酒酵母中构建Prk-RuBisCo通路的研究报道，RuBisCo活性依赖伴侣蛋白辅助。GroEL/S型伴侣蛋白虽在真核与原核生物中均存在，但细菌GroEL/S在酵母中的功能对应物定位于线粒体[16]。值得注意的是，解脂耶氏酵母与K. marxianus无需过表达伴侣蛋白基因即可实现Prk-RuBisCo通路的功能性组装，而在酿酒酵母中，共表达内源GroEL/S型伴侣蛋白基因HSP60与HSP10可促进RuBisCo正确折叠。该观察提示，解脂耶氏酵母中Prk-RuBisCo通路的功能性建立可能与其内源GroEL/S型伴侣蛋白YlHsp60与YlHsp10的活性相关。基于NCBI数据库检索，解脂耶氏酵母内源GroEL/S型伴侣蛋白YlHsp60与YlHsp10的编码基因分别为YALI1F04045g与YALI1B07652g。序列比对显示，YlHsp60与酿酒酵母ScHsp60及大肠杆菌EcGroEL的相似性分别为77.90%与55.04%，YlHsp10与ScHsp10及EcGroES的相似性分别为63.74%与46.05%。
为评估这些伴侣蛋白是否促进RuBisCo折叠，在菌株ST-203中共表达内源YlHSP60与YlHSP10。所得重组菌株ST-204在24 h时OD600为2.01，发酵结束最终OD600升至6.56（图4b与c）。然而琥珀酸滴度与得率较菌株ST-203均下降，分别为7.49 g/L与0.19 g/g（图4b与d）。这些表明内源GroEL/S型伴侣蛋白Hsp60与Hsp10对Prk-RuBisCo通路的功能性组装并非必需。研究已证明，源自大肠杆菌的GroEL/S伴侣蛋白系统能够促进毕赤酵母与酿酒酵母中RuBisCo的正确折叠[29]。在此基础上，将大肠杆菌来源的伴侣蛋白编码基因GROEL与GROES共表达于菌株ST-203以构建重组菌株ST-205。结果显示，菌株ST-205的OD600与菌株ST-203无显著差异，而琥珀酸滴度与得率均上升，分别从8.93 g/L与0.21 g/g提高至9.30 g/L与0.23 g/g（图4b）。这些表明，与酿酒酵母和毕赤酵母中的观察类似，解脂耶氏酵母中RuBisCo折叠亦可由大肠杆菌来源的伴侣蛋白GroEL与GroES辅助。
【数据】蛋白相似性：YlHsp60 vs ScHsp60 77.90%、vs EcGroEL 55.04%；YlHsp10 vs ScHsp10 63.74%、vs EcGroES 46.05%；ST-204：24 h OD600 2.01、最终6.56、7.49 g/L、0.19 g/g；ST-205：OD600与ST-203无显著差异、9.30 g/L、0.23 g/g
3.4 增强CO₂回收效率
（本节原文节选在此处中断，以下内容依据摘要与图表清单所载信息呈现，未见于节选正文的细节标注为原文未详述。）
在伴侣蛋白辅助折叠的基础上，进一步提升通路关键元件与伴侣蛋白基因的拷贝数。图5a展示了多拷贝表达策略：同一表达盒以两个拷贝整合于不同位点（P为启动子，T为终止子）。多拷贝表达关键元件与伴侣蛋白基因显著增强了CO₂回收效率，在摇瓶中相对亲本菌株实现琥珀酸滴度提高8%、得率提高32%，同时观察到甘油消耗减少与副产物总量下降，提示CO₂固定改善了氧化还原平衡。
随后在5 L生物反应器中比较ST-109与ST-206的补料分批发酵性能。在pH不调控条件下，菌株ST-206最终琥珀酸滴度达124.61 g/L，甘油到产物的转化率为0.46 g/g，生产强度为0.88 g/(L·h)。图6a与6b分别记录了ST-109与ST-206随时间变化的甘油消耗、OD600、pH与琥珀酸生产情况。
【数据】策略：多拷贝（2 copies，不同位点）；摇瓶：滴度+8%、得率+32%（相对亲本）；ST-206 5 L罐：滴度124.61 g/L、转化率0.46 g/g、生产强度0.88 g/(L·h)；pH：不调控；原文节选未详述ST-109罐上具体数值
讨论与解读
本研究将CBB循环关键酶RuBisCo与Prk整合入产琥珀酸的解脂耶氏酵母，构建出功能性异源Prk-RuBisCo CO₂固定通路，使经oTCA途径生产琥珀酸的过程实现CO₂回收。发酵曲线分析与滴度、得率的显著提升验证了策略可行性。把高还原度底物甘油的代谢优势与Prk-RuBisCo通路的碳同化能力结合，将传统排碳过程转变为碳保守生物过程。当前增益虽属中等，但引入的模块可进一步挖掘，为未来自养型解脂耶氏酵母菌株的开发奠定代谢与概念基础。
编译者解读：该工作的亮点在于"先拆后装"的理性路径——先单独评估Prk与RuBisCo的代谢效应，确认RuBP积累的毒性边界，再组装完整通路，避免了盲目叠加。选择Form II RuBisCo降低组装复杂度，是务实的合成生物学取舍。局限同样明显：CO₂固定带来的得率增益仅32%，通路通量仍受RuBisCo催化效率与Prk毒性制约；不控pH的罐上策略虽简化工艺，却把选择压力留给了菌株本身。后续若能把多拷贝与启动子库、适应性进化结合，或可逼近理论碳得率。
参考来源
期刊：Synthetic and Systems Biotechnology（2027）
DOI: 10.1016/j.synbio.2026.10.014
DOI: 10.1016/j.synbio.2026.10.014