来源：Coupling corncob fractionation with covalent enzyme assembly for resveratrol biosynthesis from lignin-derived p-coumaric acid（Bioresource Technology）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
木质素是自然界最丰富的可再生芳香碳源，但其生物转化长期受制于"分级解聚"与"微生物途径设计"之间的脱节。本研究将低温尿素-氢氧化钾（UK）分级、途径入口酶替换与SpyTag/SpyCatcher共价酶组装三者串联：UK分级从玉米芯中释放191.97 ± 7.42 mg/g Klason木质素的对香豆酸（p-CA），同时保留富纤维素渣用于糖化；以木质素源p-CA为芳香前体、糖化液为碳源，在大肠杆菌中把植物4CL换成木质素降解菌来源的CtFCS，并用共价组装拉近连续反应酶对，最终在5 L补料分批发酵中产出803.85 ± 10.06 mg/L白藜芦醇。
研究背景
木质素是储量最大的可再生芳香结构来源，理论上可支撑化石基化学品的替代生产，但在可持续生物炼制的框架下，其高效增值始终难以落地。现有白藜芦醇的从头合成平台大多依赖精制碳源，原料成本高企；碳源贡献虽因宿主与工艺设计而异，但直接使用木质素或农业残渣显然可以降低对精制糖的依赖。当前木质素升级主要走热化学解聚加微生物漏斗化路线。玉米芯在此有其独特优势——其草本木质素富含天然酯键连接的p-CA，是回收苯丙烷类前体的理想原料。白藜芦醇（3,5,4′-三羟基二苯乙烯）是食品、医药与化妆品领域的高价值苯丙烷类化合物，从植物中提取耗溶剂量大、产量不稳，微生物生产因而受到越来越多关注。本研究即以此为模型，检验"分级—途径—组装"协同设计的可行性。
研究方法
2.1 菌株、培养基与化学试剂
本研究所用全部菌株与质粒分别列于表S1和表S2。大肠杆菌DH5α用于克隆与质粒扩增，大肠杆菌BL21(DE3)用于异源蛋白表达与白藜芦醇生产。Luria-Bertani（LB）培养基含10 g/L胰蛋白胨、5 g/L酵母提取物和10 g/L NaCl，用于种子培养与质粒扩繁。胰蛋白胨与酵母提取物购自BD Difco（美国）；生产培养基中使用的是同一种酵母提取物。各维生素组分购自Sigma-Aldrich（美国）。固体培养基另加20 g/L琼脂。抗生素按需加入，终浓度分别为100 μg/mL氨苄青霉素、50 μg/mL卡那霉素或34 μg/mL氯霉素。白藜芦醇在改良M9基础培养基中生产，并补充表S3所列的微量元素与维生素。M9基础盐与酵母提取物一同高压灭菌。单独灭菌的碳水化合物母液以及经0.22 μm过滤的微量元素和维生素溶液，在基础培养基冷却后无菌加入；制备细节见补充方法1.4和1.8。p-CA（≥98%）与白藜芦醇（≥98%）标准品购自麦克林（中国上海）。二甲基亚砜（DMSO）、葡萄糖和异丙基-β-D-1-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）购自生工生物（中国上海）。其余试剂均为分析纯，直接使用。
【数据】培养基：LB（10 g/L胰蛋白胨、5 g/L酵母提取物、10 g/L NaCl）；固体培养基琼脂：20 g/L；抗生素终浓度：氨苄青霉素100 μg/mL、卡那霉素50 μg/mL、氯霉素34 μg/mL；标准品纯度：p-CA ≥98%、白藜芦醇 ≥98%；滤膜孔径：0.22 μm；其余原文未详述
2.2 质粒构建
引物序列及Spy模块/连接肽序列见表S4，质粒图谱见图S1。拟南芥At4CL、Clostridium thermodepolymerans CtFCS和葡萄VvSTS的编码序列经高保真聚合酶链式反应（PCR）扩增后，克隆至相应表达载体。针对每一对上游酶/VvSTS组合，构建了三套双质粒系统，以便在匹配的载体背景下比较Spy介导的组装。U构型中，上游酶与VvSTS共表达，不带SpyTag或SpyCatcher。N构型中，At4CL–SpyTag或CtFCS–SpyTag与VvSTS–SpyCatcher(E77Q)配对。S构型则使用相应的反应性SpyTag/SpyCatcher对。E77Q替换通过全质粒定点突变引入含SpyCatcher的质粒；该替换已被用作SpyTag/SpyCatcher异肽键形成的非反应性对照（Zakeri et al., 2012）。
【数据】构型：U（无Spy标签）、N（SpyCatcher E77Q非反应性对照）、S（反应性SpyTag/SpyCatcher）；突变方式：全质粒定点突变；突变位点：SpyCatcher E77Q；酶来源：拟南芥At4CL、C. thermodepolymerans CtFCS、葡萄VvSTS；其余原文未详述
2.3 从玉米芯中回收木质素源p-CA
#### 2.3.1 UK预处理与固液分离
玉米芯、高粱秸秆和花生壳均采购自中国江苏省苏州市张家港。原料经粉碎、60 °C干燥至含水率低于8%，过40目筛。每次预处理取2.50 g干生物质，与75.0 mL处理液在250 mL挡板瓶中混合，对应每30 mL预处理液1 g干生物质。所选UK处理液含1.0 M KOH，尿素按KOH:尿素质量比1:1加入（Zahoor et al., 2023），预处理在50 °C、160 rpm下进行4 h。另以1.0 M NaOH在相同温度、振荡、反应时间和固液比条件下作平行处理，作为常规碱预处理基准。预处理后，浆液经150目筛网过滤，分离出用于p-CA回收的碱性液相与用于酶法糖化的富纤维素固相。工艺优化所用范围、重复定义及组分回收率计算见补充方法1.1；配方名义输入与所选分级结果汇总于表S5。
【数据】生物质：玉米芯、高粱秸秆、花生壳；干燥温度：60 °C；含水率：<8%；筛目：40目；生物质用量：2.50 g；处理液体积：75.0 mL；固液比：1 g/30 mL；KOH浓度：1.0 M；KOH:尿素质量比：1:1；温度：50 °C；转速：160 rpm；时间：4 h；过滤筛目：150目；NaOH对照浓度：1.0 M
#### 2.3.2 p-CA的分离与纯化
p-CA回收时，碱性液相用H2SO4酸化至pH 3.0，随后经热-冷结晶获得粗p-CA。粗品重结晶两次，经高效液相色谱（HPLC）测定纯度≥97%。p-CA得率以未处理生物质的Klason木质素含量归一化，Klason木质素按NREL实验室分析规程测定。得率计算与分析流程见补充方法1.2.1。
【数据】酸化试剂：H2SO4；酸化终点：pH 3.0；结晶方式：热-冷结晶；重结晶次数：2次；纯度：≥97%；归一化基准：Klason木质素；测定方法：NREL实验室分析规程、HPLC
#### 2.3.3 纤维素源糖化液的制备
UK固液分离所得富纤维素固相用去离子水洗涤两次至中性，随后悬浮于50 mM柠檬酸缓冲液中，固含量15%（w/v）。里氏木霉纤维素酶（Celluclast 1.5 L；Sigma-Aldrich，美国）与绿色木霉内切-1,4-β-木聚糖酶M1（Megazyme，爱尔兰）按每克葡聚糖合计15 mg蛋白的装载量加入。酶解在50 °C、150 rpm下进行72 h，之后以8,000 × g离心10 min去除残余固相。回收的含糖流被称为纤维素源糖化液，以区别于用于p-CA回收的UK碱性液相。其葡萄糖与木糖浓度经带示差折光检测的HPLC定量。脱毒时，糖化液与0.5%（w/v）粉末活性炭（分析纯；国药集团化学试剂有限公司）在室温下孵育30 min，经0.22 µm膜过滤，再于0.08 MPa、50 °C下真空脱气30 min。这些步骤用于降低糠醛、5-羟甲基糠醛和木质素源酚类。脱毒糖化液随后被浓缩，作为配制初始生产培养基和补料液的通用碳水化合物流。
【数据】缓冲液：50 mM柠檬酸；固含量：15%（w/v）；酶装载量：15 mg蛋白/g葡聚糖；酶解温度：50 °C；转速：150 rpm；时间：72 h；离心：8,000 × g、10 min；活性炭：0.5%（w/v）；脱毒时间：30 min；脱毒温度：室温；过滤孔径：0.22 µm；真空脱气：0.08 MPa、50 °C、30 min
2.4 匹配U、N、S系统的验证与定量
匹配的U、N、S菌株通过将相应pACYCDuet-1与pETDuet-1衍生质粒共转化大肠杆菌BL21(DE3)获得。Spy依赖的复合物形成在诱导后48 h检查，所用培养物分别表达单个含Spy蛋白或匹配的N、S蛋白对。细胞裂解后未将蛋白伴侣共孵育，以确保检测到的复合物是在细胞表达过程中形成的。SpyCatcher(E77Q) N菌株作为相应反应性S菌株的非反应性对照。可溶性蛋白定量时，按生物量归一化的细胞沉淀在等体积裂解缓冲液中破碎，离心回收可溶组分。上游酶、VvSTS及复合物尺寸物种在非饱和曝光条件下经免疫印迹测定。免疫印迹使用抗At4CL、抗CtFCS和抗VvSTS抗体，纯化蛋白作为校准标准。支持性免疫印迹、校准方程及各培养物条带强度见图S10和表S16。详细验证、体外组装、pH稳定性及定量流程见补充方法1.5。
【数据】宿主：E. coli BL21(DE3)；载体：pACYCDuet-1、pETDuet-1；检测时间点：诱导后48 h；复合物检测：免疫印迹（非饱和曝光）；抗体：抗At4CL、抗CtFCS、抗VvSTS；校准：纯化蛋白标准品；其余原文未详述
2.5 上游酶活性与动力学测定
活化-缩合酶对最初在500-μL反应体系中比较，体系含50 mM Tris-HCl（pH 8.0）、0.5 mM p-CA、5 mM ATP、2 mM CoA、5 mM MgCl2、1 mM丙二酰辅酶A，以及各10 μM的上游酶与VvSTS。30 °C孵育60 min后，用等体积冰甲醇终止反应，HPLC定量白藜芦醇。At4CL与CtFCS的稳态动力学测定在30 °C下进行，酶浓度0.5 μM，p-CA浓度范围10至500 μM。p-CCoA的初始生成在333 nm监测。表观Km与kcat值通过非线性拟合Michaelis-Menten方程获得。SpyTag/SpyCatcher及共价组装对上游酶活性的影响另做检验（原文此处节选结束）。
【数据】反应体积：500 μL；缓冲液：50 mM Tris-HCl（pH 8.0）；p-CA：0.5 mM；ATP：5 mM；CoA：2 mM；MgCl2：5 mM；丙二酰辅酶A：1 mM；酶浓度：各10 μM；温度：30 °C；时间：60 min；动力学酶浓度：0.5 μM；p-CA范围：10–500 μM；检测波长：333 nm；终止方式：等体积冰甲醇
研究结果
3.1 p-CA的回收与富纤维素残渣的增值
#### 3.1.1 玉米芯木质素中p-CA的释放与纯化
低温UK分级从三种受试富木质素农业残渣——玉米芯、高粱秸秆和花生壳——中均释放出p-CA。玉米芯得率最高，1.0 M NaOH作常规碱法基准。分级流程见图1A。
三种原料中均检测到保留时间分别与p-CA和和阿魏酸标准品一致的HPLC峰，分别为8.5和9.5 min（UV 310 nm；图1B）。在选定UK条件下，对玉米芯p-CA得率做了详细定量。1.0 M KOH、KOH:尿素质量比1:1、50 °C、4 h、固液比1:30 g/mL时，得率达每克Klason木质素191.97 ± 7.42 mg p-CA，约为相应1.0 M NaOH处理的兩倍（P < 0.01；图1C）。工艺筛选中，KOH浓度从0.2升至1.0 mol/L可提高p-CA得率，但继续升至2.0 mol/L无额外效果。1.0 mol/L KOH下，得率在4至6 h达到峰值，延长处理则略有下降（图1D）。后续实验因此在50 °C、固液比1:30（g:mL）下进行（图1E）。H2SO4酸化后经热-冷结晶回收p-CA，总回收率82.4 ± 3.6%，纯度至少97%。UK处理还保留了初始纤维素的91.3 ± 1.8%，而NaOH基准仅保留72.5 ± 2.4%（表S5）。
【数据】p-CA得率：191.97 ± 7.42 mg/g Klason木质素；NaOH对照得率：约半数（P < 0.01）；KOH浓度：0.2–2.0 mol/L；温度：50 °C；时间：4 h（峰值4–6 h）；固液比：1:30 g/mL；回收率：82.4 ± 3.6%；纯度：≥97%；纤维素保留率：UK 91.3 ± 1.8% vs NaOH 72.5 ± 2.4%；HPLC保留时间：p-CA 8.5 min、阿魏酸 9.5 min；检测波长：310 nm
#### 3.1.2 纤维素源糖化液的生产
UK预处理后回收的富纤维素固相经糖化，每100 g干玉米芯产出28.6 ± 1.2 g葡萄糖和6.8 ± 0.5 g木糖（图1F）。活性炭处理与真空脱气去除了87.6 ± 3.2%的总酚类，并将糠醛和5-羟甲基糠醛均降至0.5 mg/L以下（图1G）。因此，UK分级从玉米芯得到两股可用物流。碱性液相提供木质素源p-CA作为芳香前体，富纤维素固相糖化则提供富葡萄糖碳源用于发酵。高纤维素保留率加之酚类与呋喃类抑制物的去除，产出了适合后续白藜芦醇生产的糖化液。不过，该流程用水量大，且需要固相洗涤、酸化、结晶和糖化液调理。放大工艺将要求更低的水与试剂消耗，以及过程化学品的有效回收与再利用。
【数据】葡萄糖：28.6 ± 1.2 g/100 g干玉米芯；木糖：6.8 ± 0.5 g/100 g干玉米芯；总酚去除率：87.6 ± 3.2%；糠醛与5-HMF：均<0.5 mg/L；其余原文未详述
3.2 CtFCS–VvSTS在体外优于经典At4CL–VvSTS模块
纯化的双酶模块清楚显示，作为白藜芦醇生物合成的途径入口酶，CtFCS较At4CL具明显优势。每个模块将VvSTS与At4CL或CtFCS配对（图2A）。
所有酶组合均在相同反应条件下测试。310 nm UV检测的HPLC分析将p-CA与白藜芦醇分别于8.5和15.3 min保留时间分离，确认重构反应中白藜芦醇的生成（图2B）。系统发育分析为酶筛选所用的4CL、FCS和STS候选提供了序列背景（图2C）。终点白藜芦醇产量在受试4CL–STS与FCS–STS组合间存在差异（图2D）。CtFCS–VvSTS滴度最高，达61.83 ± 3.33 mg/L，而相同条件下At4CL–VvSTS为34.8 ± 3.1 mg/L（n = 3个独立蛋白制备批次）。动力学测定呈现相同趋势。CtFCS对p-CA的表观Km为42.3 μM，At4CL为78.5 μM。其表观催化效率也高2.1倍，kcat/Km分别为1.28 × 10⁴和0.61 × 10⁴ M⁻¹ s⁻¹（表S8）。基于这些结果，含pACYCDuet-1-CtFCS与pETDuet-1-VvSTS的双质粒底盘被推进至组装实验（图2E）。初筛与后续U/N/S实验在不同酶浓度下进行。无标签酶对按每酶10 μM筛选，而匹配的U、N、S系统按每酶1 μM测试。因此终点筛选用于选出先导模块，而非为组装实验提供定量基线。在此范围内，终点白藜芦醇生成与动力学测定的一致，将CtFCS-VvSTS的表现与更高效的p-CA活化联系起来。FCS酶天然参与细菌羟基肉桂酸分解代谢，因而与木质素源芳香酸流相容（Frank et al., 2018; Sodré et al., 2019）。高效活化之所以重要，是因为VvSTS需要p-CCoA作为起始底物（Abe & Morita, 2010; Obel & Scheller, 2000）。我们因此以CtFCS-VvSTS为先导模块，保留At4CL-VvSTS作经典对照。这些结果将CtFCS鉴定为与原料相容的途径入口酶，但并未表明p-CA活化是完整途径中唯一的限速步骤。
【数据】白藜芦醇滴度：CtFCS–VvSTS 61.83 ± 3.33 mg/L vs At4CL–VvSTS 34.8 ± 3.1 mg/L（n = 3）；CtFCS Km：42.3 μM；At4CL Km：78.5 μM；kcat/Km：CtFCS 1.28 × 10⁴ M⁻¹ s⁻¹、At4CL 0.61 × 10⁴ M⁻¹ s⁻¹（高2.1倍）；HPLC保留时间：p-CA 8.5 min、白藜芦醇 15.3 min；检测波长：310 nm；初筛酶浓度：10 μM/酶；U/N/S实验酶浓度：1 μM/酶
3.3 SpyTag/SpyCatcher介导的共价酶组装验证
针对At4CL-VvSTS与CtFCS-VvSTS分别构建了载体背景匹配的U、N、S系统（图3A）。
在立即变性的全细胞样品中，反应性At4CL–VvSTS与CtFCS–VvSTS S菌株在组装酶对计算分子量附近显示明显条带（图S8）。在相同取样与变性流程下，匹配的N菌株主要显示对应单个融合蛋白的条带，缺乏同等显著的复合物尺寸物种（图S9）。纯化蛋白经SDS-PAGE显示预期单条带，反应性酶对则形成涉及上游酶与VvSTS的额外复合物尺寸物种（图3B）。组装蛋白在30 °C、pH 4、6、8或10下孵育2 h后，复合物尺寸条带仍可检出。可溶性蛋白丰度并不能解释复合物形成。诱导后48 h采集的生物量归一化提取物中，对可溶性上游酶、VvSTS及复合物尺寸物种的丰度做了定量（图3C、图S10和表S16）。CtFCS-VvSTS的U、N、S菌株间，CtFCS与VvSTS总丰度相近。At4CL-VvSTS系列三组间显示轻微差异。两个系统中，复合物尺寸物种主要在反应性S菌株中检出，而相应信号在U和N对照中明显更低。匹配对照表明这些物种主要经反应性SpyTag/SpyCatcher化学形成。SpyCatcher(E77Q)保留了标签结构但阻止共价键形成，说明仅共表达带标签蛋白并不产生S菌株中的显著条带。CtFCS-VvSTS系列中，复合物形成未伴随任一酶可溶性总丰度的增加。因此结果不能简单用更大的可溶性酶池解释。总体而言，细胞样品支持存在与共价酶组装一致的抗变性物种。该证据验证了复合物形成，但其本身既未表明组装改善途径功能，也未解释改进如何发生。组装的功能效应因此分别从上酶活性、终产物生成和时间分辨的p-CCoA动态三方面评估，以判定共价组织是否改善了双酶级联内的偶联。
【数据】检测时间点：诱导后48 h；孵育稳定性：30 °C、2 h、pH 4/6/8/10；复合物检测：SDS-PAGE与免疫印迹；定量对象：可溶性上游酶、VvSTS、复合物尺寸物种；对照：SpyCatcher(E77Q)非反应性N菌株；其余原文未详述
3.4 SpyTag/SpyCatcher组装改善CtFCS–VvSTS级联性能并减少p-CCoA积累
SpyTag/SpyCatcher融合与共价组装均未提高上游酶的（原文此处节选结束）。
讨论与解读
本研究证明，玉米芯分级与途径工程可以协同，把互补的生物质组分转化为白藜芦醇。低温UK分级释放木质素源p-CA，同时保留富纤维素固相以生产富葡萄糖糖化液。以CtFCS替换植物4CL，通过提高p-CA活化效率改善了途径入口。在载体背景匹配的重构级联中，反应性SpyTag/SpyCatcher组装提高了白藜芦醇生成、降低了p-CCoA暴露，而可溶性酶丰度与上游酶活性并未增加——这与连续反应间偶联改善相一致。探索性结构建模与分子动力学提示，酶对组织方式与配体行为的改变可能贡献于级联偶联的改善。以纯化的木质素源p-CA和脱毒纤维素糖化液为底物，工程菌株在5 L补料分批发酵中产出803.85 ± 10.06 mg/L白藜芦醇。分级与酶筛选结果共同识别了影响前体供给与活化的因素；重构级联进一步提示反应性酶组装可改善连续反应间的协调。后续开发应优先考虑无共溶剂p-CA递送、葡萄糖-木糖共利用、碳分配优化、低溶剂产品回收及定量（原文节选至此）。
编译者解读：该工作的亮点不在单点突破，而在"分级—入口酶—空间组装"三层匹配：UK分级同时产出芳香前体与可发酵糖，CtFCS把木质素降解菌的底物习惯移植进异源途径，SpyTag/SpyCatcher则用共价键把连续反应拉近，绕开了代谢工程中常见的"酶量堆叠"思路。局限也明显：p-CA仍需有机溶剂辅助递送、木糖未充分利用、5 L规模到工业放大之间隔着水耗与试剂回收的坎。作为概念验证，它给出了"生物质分级决定途径设计"的范式。
参考来源
期刊：Bioresource Technology, 2026
DOI: 10.1016/j.biortech.2026.136220
DOI: 10.1016/j.biortech.2026.136220