来源：Nisin Against Bacillus cereus Spores: Activity, Characterization, and Beef Application（Journal of Food Protection）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
耐热芽孢菌是即食食品腐败的主要元凶。本研究从胀袋熟牛肉中分离鉴定腐败菌，锁定蜡样芽孢杆菌为对象，系统评估乳酸链球菌素（nisin）对芽孢萌发与出芽的阶段特异性作用。研究发现 nisin 对蜡样芽孢杆菌芽孢的 MIC 为 400 µg/mL，低浓度反而促进萌发、却显著阻断后续出芽，并伴随膜完整性破坏、氧化应激与能量代谢紊乱；转录组揭示 3049 个差异基因，熟牛肉实验证实其可延长货架期。
研究背景
耐热芽孢杆菌是即食（RTE）食品腐败的主要来源，其芽孢能耐受高温、低 pH、高压等加工条件，一旦环境适宜便萌发为代谢活跃的营养细胞，造成食品变质。蜡样芽孢杆菌既是常见的食源性病原菌，也会产生肠毒素或呕吐毒素 cereulide，引发食物中毒。中国一项调查显示，牛肉中蜡样芽孢杆菌的检出率为 22.58%，加工肉制品污染率（41.94%）明显高于生肉（24.58%）。因此，阻断芽孢向营养细胞转变是控制此类污染的关键。
Nisin 是 GRAS 级抗菌肽，对芽孢菌有较强活性，但它在芽孢萌发与出芽各阶段的具体作用尚不清楚。本研究从胀袋熟牛肉中分离耐热腐败菌，以蜡样芽孢杆菌为模型，结合表型与转录组手段解析 nisin 的抑芽孢机制，并在熟牛肉中验证其保鲜效果。
研究方法
试剂与菌株。 Nisin（≥1000 IU/mg）购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司。其余化学试剂均为分析纯。蜡样芽孢杆菌 ATCC14579 购自美国典型培养物保藏中心（ATCC）。
【数据】试剂：nisin（≥1000 IU/mg，阿拉丁）；菌株：B. cereus ATCC14579；其余试剂：分析纯；原文未详述其他参数
从腐败熟牛肉中分离细菌。 从西安某超市采集两包已腐败胀袋的牛肉。取 25 g 腐败牛肉样品，加入 225 mL 无菌 0.85%（w/v）生理盐水，用振荡均质器均质 15 min。均质悬液进行梯度稀释，取适当体积涂布于平板计数琼脂（PCA）。37 ℃ 培养 24 h 后记录菌落数。挑选形态不同的菌落，在 PCA 平板上反复划线纯化，直至菌落特征与细菌染色形态一致。分离菌株于 −80 ℃、50% 甘油中保存。
【数据】样品：腐败胀袋熟牛肉 25 g；稀释液：225 mL 无菌 0.85% 生理盐水；均质时间：15 min；培养基：PCA；温度：37 ℃；时间：24 h；保存：50% 甘油、−80 ℃
分离菌的分子鉴定。 用商品化细菌基因组 DNA 提取试剂盒（湖南艾科瑞生物，长沙）提取分离菌株基因组 DNA。以通用引物 27F（5′-AGAGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3′）和 1492R（5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′）通过 PCR 扩增全长 16S rDNA 基因，方法参照前人报道（Deng et al., 2021）。纯化后的 PCR 扩增片段送杨凌奥科进行 16S rRNA 基因 Sanger 测序。所得序列用 NCBI 数据库比对，并用 MEGA 11 基于邻接法构建系统发育树（Tan et al., 2025）。
【数据】引物：27F/1492R；扩增目标：全长 16S rDNA；测序：Sanger；比对：NCBI；建树软件：MEGA 11；算法：邻接法；原文未详述 PCR 体系与程序
致病性分析。 小鼠感染实验经西北农林科技大学动物伦理委员会批准（项目号 IAcuc 2024-1004），按相关动物福利指南执行。六周龄 Balb/c 小鼠随机分组，每组 6 只。分离菌株活化后，用无菌 PBS 调整浓度至 10⁸ CFU/mL。每只小鼠按每 10 g 体重腹腔注射 100 µL 菌悬液，24 h 内每 2 h 连续观察临床状况。
【数据】小鼠：六周龄 Balb/c，每组 6 只；菌浓度：10⁸ CFU/mL；接种：腹腔注射 100 µL/10 g 体重；观察：每 2 h、持续 24 h；伦理批号：IAcuc 2024-1004
腐败酶产生与溶血活性评价。 分离菌的腐败酶产生能力参照 Wang et al.（2021）方案并稍作修改。蛋白、脂质和淀粉酶水解分别用添加 10% 脱脂乳的 PCA 平板、三丁酸甘油酯琼脂平板和淀粉水解培养基平板（含胰蛋白胨 10 g/L、酵母提取物 10 g/L、可溶性淀粉 20 g/L、琼脂 15 g/L）测定。37 ℃ 培养 24 h 后，以淀粉水解透明圈直径与菌落直径之比（HC 值）作为腐败酶活性指标。溶血活性用添加 6% 脱脂绵羊血的 TSA 平板评价。
【数据】蛋白水解：PCA + 10% 脱脂乳；脂解：三丁酸甘油酯琼脂；淀粉水解培养基：胰蛋白胨 10 g/L、酵母提取物 10 g/L、可溶性淀粉 20 g/L、琼脂 15 g/L；温度：37 ℃；时间：24 h；溶血：TSA + 6% 脱脂绵羊血；指标：HC 值
分离菌营养细胞与芽孢的耐热性比较。 由"从腐败熟牛肉中分离细菌"一节结果可知，6 株分离菌均鉴定为芽孢杆菌属。熟牛肉加工通常涉及热处理，故比较分离菌营养细胞与芽孢的耐热性，以确定此类食品微生物控制的关键靶标。用无菌 PBS 将菌悬液调整至 10⁷ CFU/mL，随后于 100 ℃ 分别热处理 10、20、30 和 60 min。热处理后立即转入冰水浴快速冷却至室温，再梯度稀释涂布 PCA 计数。
【数据】菌浓度：10⁷ CFU/mL；温度：100 ℃；时间：10、20、30、60 min；冷却：冰水浴；计数：PCA 涂布
MIC 与 SIC 测定。 采用肉汤微量稀释法并稍作修改，测定 nisin 对蜡样芽孢杆菌 ATCC 14579 及分离菌株（1-1、1-2、1-3、2-1、2-2、2-3）芽孢与营养细胞的最低抑菌浓度（MIC）（Wan et al., 2025）。同时每小时测定不同浓度 nisin（1/64 MIC–2 MIC）处理菌悬液的 OD600，最终绘制生长曲线。
【数据】方法：肉汤微量稀释法；nisin 浓度范围：1/64 MIC–2 MIC；检测：OD600 每小时测定；菌株：ATCC 14579 及 1-1、1-2、1-3、2-1、2-2、2-3
Nisin 处理芽孢的生长。 参照 Cai et al.（2019）方案稍作调整评估 nisin 暴露后芽孢的生长。简言之，将蜡样芽孢杆菌 ATCC 14579 芽孢浓度调整至 LB 肉汤中 10⁶ CFU/mL，分别添加 0、1/2 MIC、1 MIC 和 2 MIC 的 nisin，37 ℃ 培养 24 h。于 0、2、4、6、12 和 24 h 取样。为区分营养细胞与芽孢，一半样品梯度稀释涂布进行总菌落计数；另一半于 80 ℃ 水浴 10 min 以杀灭营养细胞，随后梯度稀释涂布计数芽孢。
【数据】芽孢浓度：10⁶ CFU/mL；培养基：LB 肉汤；nisin：0、1/2 MIC、1 MIC、2 MIC；温度：37 ℃；时间：24 h；取样点：0、2、4、6、12、24 h；芽孢计数热处理：80 ℃、10 min
吸光度变化对蜡样芽孢杆菌芽孢萌发与出芽的影响。 参照 Fan et al.（2019）稍作修改评估芽孢萌发与出芽。将芽孢悬液调整至 LB 肉汤中终浓度 10⁶ CFU/mL，分别添加 1/4、1/2、1、2 MIC 的 nisin。37 ℃ 培养，每 10 min 用多功能酶标仪（Spark，奥地利）测定各培养物吸光度。对每份样品，以各时间点吸光度除以 t = 0 min 的初始 OD600 计算萌发率。
【数据】芽孢终浓度：10⁶ CFU/mL；培养基：LB 肉汤；nisin：1/4、1/2、1、2 MIC；温度：37 ℃；检测间隔：每 10 min；仪器：Spark 多功能酶标仪；萌发率：各时间点吸光度/初始 OD600
芽孢染色。 不同浓度 nisin 处理 2 h 后，收集菌体，13,800 g 离心 5 min，PBS 洗涤 3 次。随后用芽孢染色试剂盒（环凯，广州，029020）按说明书进行孔雀绿加热染色与番红复染。染色样品于光学显微镜（Leica Microsystems，韦茨拉尔，德国）下观察。
【数据】处理时间：2 h；离心：13,800 g、5 min；洗涤：PBS 3 次；试剂盒：环凯 029020；染色：孔雀绿加热染色 + 番红复染；显微镜：Leica 光学显微镜
扫描电镜（SEM）观察细胞形态。 参照前人方法适当修改考察蜡样芽孢杆菌形态特征（Bai et al., 2022）。接"芽孢染色"一节后，菌体用 PBS 洗涤 3 次，2.5% 戊二醛 4 ℃ 固定过夜。固定后经梯度乙醇（10%、30%、50%、70%、80%、95%、100%，v/v）脱水，每级 15 min。干燥后喷金，于 5 kV 加速电压下 SEM 采集图像。
【数据】固定：2.5% 戊二醛、4 ℃、过夜；脱水：10%–100% 乙醇梯度、每级 15 min；喷金；SEM 加速电压：5 kV
Nisin 处理后蜡样芽孢杆菌芽孢核酸与蛋白释放。 参照 Zhu et al.（2024）方案适当修改测定芽孢核酸与蛋白释放。蜡样芽孢杆菌芽孢于 LB 肉汤中用不同剂量 nisin（0（对照）、1/2 MIC、1 MIC、2 MIC）处理 1 h。4 ℃、13,800 g 离心 5 min 收集上清，用微量分光光度计（K5800C，凯奥，北京）测定各组上清核酸与蛋白含量。
【数据】培养基：LB 肉汤；nisin：0、1/2 MIC、1 MIC、2 MIC；处理时间：1 h；离心：4 ℃、13,800 g、5 min；仪器：K5800C 微量分光光度计
NPN 摄取。 参照前人方法稍作修改测定 NPN 摄取（Xu et al., 2017）。简言之，按 2.5.1 处理蜡样芽孢杆菌芽孢后，4 ℃、13,800 g 离心 5 min 收集菌体，洗涤 2 次，重悬于 PBS。取 200（原文此处截断）
【数据】离心：4 ℃、13,800 g、5 min；洗涤：PBS 2 次；重悬：PBS；原文在此处截断，后续参数未详述
研究结果
菌株分离与鉴定。 对腐败即食牛肉样品进行菌落计数与细菌分离。如图 1A 所示，两份样品的总活菌数（TVBCs）分别为 7.19 和 5.52 log CFU/g。从每个样品平板上随机挑选 3 个形态特征不同的菌落进行纯培养。分离菌株的 16S rDNA 测序结果见图 1B。1-1、1-3 和 2-3 与枯草芽孢杆菌聚为一支；2-1 与解淀粉芽孢杆菌聚为一支；1-2 和 2-2 与蜡样芽孢杆菌聚为一支。
【数据】样品总活菌数：7.19 和 5.52 log CFU/g；每板挑取菌落：3 个；鉴定：1-1、1-3、2-3 为 B. subtilis，2-1 为 B. amyloliquefaciens，1-2、2-2 为 B. cereus
分离菌致病性、产腐败酶能力与耐热性评价。 图 1C 显示分离菌的致病性特征。与蜡样芽孢杆菌聚为一支的菌株 1-1 和 1-2 在小鼠中的致病性显著强于本研究中其他芽孢杆菌。结果显示，所有受试芽孢杆菌初期均产生明显的透明圈，表明具有蛋白水解与脂解活性。1-2 和 2-2 菌株未形成淀粉水解透明圈，但在血琼脂平板上表现出溶血活性（图 1D 和图 S1）。图 1E 显示分离菌营养细胞与芽孢的耐热性比较。在 100 ℃ 加热环境下，分离菌 1-1 和 1-3 的营养细胞分别在 20 min 和 30 min 降至检测限以下。相比之下，芽孢即使加热 60 min 仍显示大量存活菌。
【数据】温度：100 ℃；营养细胞降至检测限时间：1-1 为 20 min、1-3 为 30 min；芽孢：60 min 后仍大量存活；溶血：1-2、2-2 阳性；淀粉水解：1-2、2-2 阴性
Nisin 对芽孢杆菌芽孢的抑制作用。 Nisin 对蜡样芽孢杆菌 ATCC 14579 及另外 6 株分离菌营养细胞和芽孢的 MIC 为 200 µg/mL 至 400 µg/mL（表 S1）。选取蜡样芽孢杆菌 ATCC 14579 芽孢作为后续机制研究的模型。用一系列 nisin 浓度绘制生长曲线以评价对芽孢生长的影响。如图 2 所示，1 MIC 和 2 MIC 的 nisin 完全抑制 LB 肉汤中芽孢生长，而低于 1/8 MIC 的浓度与对照组相比无明显抑制作用。据此，低于 1/8 MIC 的浓度定义为亚抑菌浓度（SICs）。进一步用时间-杀菌曲线评价抑制作用。如图 3A 所示，1/2 MIC 的 nisin 降低总活菌数的生长速率，但 6 h 后与未处理组相比无显著差异。然而，1 MIC 和 2 MIC 的总菌落数分别仅为 3.09 log CFU/mL 和 2.82 log CFU/mL，显著低于对照组的 8.05 log CFU/mL（P < 0.05）。芽孢计数数据（图 3B）表明，1 MIC 和 2 MIC 的 nisin 处理 2 h 后较对照组显著降低（P < 0.05）。
【数据】MIC 范围：200–400 µg/mL；完全抑制浓度：1 MIC、2 MIC；无显著抑制：<1/8 MIC（定义为 SIC）；6 h 总菌数：1 MIC 为 3.09 log CFU/mL、2 MIC 为 2.82 log CFU/mL、对照 8.05 log CFU/mL（P < 0.05）；芽孢计数：1 MIC、2 MIC 处理 2 h 后显著低于对照（P < 0.05）
Nisin 促进芽孢萌发但抑制后续出芽。 为确定 nisin 是否影响芽孢萌发与出芽，测定了芽孢悬液吸光度变化并进行显微观察。通过监测 OD600 相对于菌悬液初始光密度的下降，评价不同浓度 nisin（0、1/4、1/2、1、2 MIC）对芽孢萌发与出芽的影响。如图 4A 所示，nisin 处理以剂量依赖方式增强初始 20 min 内 OD600 的下降，1 MIC 和 2 MIC 组的吸光度下降显著大于对照组（P < 0.05），表明 nisin 促进芽孢萌发。20 min 后，对照组吸光度开始上升，反映出芽开始。60 min 后，1/2 MIC 组吸光度开始上升，而 1 MIC 和 2 MIC 组无上升趋势（图 4B），表明高浓度 nisin 阻断了后续出芽。除吸光度测定外，还用光学显微镜和 SEM 直观评估蜡样芽孢杆菌芽孢的萌发状态。对照组中，芽孢染成红色，培养 2 h 后萌发为表面光滑的规则杆状细胞（图 4C、D）。随着 nisin 浓度升高，红色杆状细胞比例逐渐下降，SEM 显示芽孢结构皱缩、破裂，2 MIC 组最为明显。综合来看，萌发初期 OD600 下降加快、出芽期 OD600 上升减弱，以及显微镜下杆状细胞比例降低，共同表明 nisin 促进芽孢萌发但以剂量依赖方式显著抑制后续出芽，在 1 MIC 浓度下实现完全出芽抑制。
【数据】nisin 浓度：0、1/4、1/2、1、2 MIC；萌发期：初始 20 min 内 OD600 下降呈剂量依赖，1 MIC、2 MIC 显著大于对照（P < 0.05）；对照吸光度上升起点：20 min 后；1/2 MIC 上升起点：60 min 后；1 MIC、2 MIC：无上升趋势；显微观察：2 h；完全出芽抑制浓度：1 MIC
Nisin 破坏芽孢萌发与出芽过程中的内膜完整性。 为确定 nisin 是否通过膜破坏发挥抗菌活性，评估了多项膜完整性指标，包括胞内核酸与蛋白泄漏、NPN 摄取、膜电位和 PI 染色。首先通过定量胞内核酸与蛋白泄漏评价 nisin 对内膜通透性的影响。如图 5A 所示，胞外核酸浓度随 nisin 浓度升高逐渐增加。类似地，胞外蛋白浓度呈剂量依赖增加（图 5B）。NPN 摄取进一步反映内膜通透性变化。图 5C 显示 nisin 处理后细胞的 NPN 摄取。NPN 摄取随 nisin 浓度升高逐渐增加，但 1 MIC 与 2 MIC 处理组间无显著差异（P > 0.05）。除通透性变化外，还测定了细胞膜电位。如图 5D 所示，与对照组相比，nisin 处理后胞内荧光强度显著增加（P < 0.05），表明细胞膜发生去极化。此外，2 MIC 的荧光强度显著高于 1 MIC（P < 0.05）。进一步用 PI 染色在单细胞水平验证膜损伤。与对照组相比，1 MIC 和 2 MIC 的 nisin 处理组红色荧光显著增强（图 5E）。胞内核酸与蛋白泄漏增加、NPN 摄取增强、膜去极化及 PI 染色阳性共同表明，nisin 处理破坏芽孢萌发与出芽过程中细胞内膜的完整性与通透性，导致膜功能丧失。
【数据】胞外核酸：随 nisin 浓度升高而增加；胞外蛋白：剂量依赖增加；NPN 摄取：随浓度升高增加，1 MIC 与 2 MIC 间无显著差异（P > 0.05）；膜电位：nisin 处理后胞内荧光显著增强（P < 0.05），2 MIC 显著高于 1 MIC（P < 0.05）；PI 染色：1 MIC、2 MIC 红色荧光显著增强
Nisin 在芽孢萌发与出芽过程中诱导氧化应激与能量耗竭。 为进一步探究 nisin 诱导膜损伤的下游生理后果，测定了芽孢萌发与出芽过程中的胞内 ROS 水平与 ATP 浓度。图 6A 显示 nisin 处理后蜡样芽孢杆菌的胞内 ROS 水平。对照组 ROS 水平持续较低。Nisin 处理后，胞内 ROS 水平以剂量依赖方式显著升高（P < 0.05），表明 nisin 诱导细胞氧化应激。除氧化应激外，nisin 处理显著影响胞内能量状态。如图 6B 所示，对照组胞内 ATP 浓度为 1.54 ± 0.09 μM。1/2 MIC nisin 处理使胞内 ATP 浓度显著降低（P < 0.05）至 0.41 ± 0.08 μM。此外，ATP 泄（原文此处截断）
【数据】ROS：随 nisin 浓度升高显著增加（P < 0.05）；对照胞内 ATP：1.54 ± 0.09 μM；1/2 MIC 处理胞内 ATP：0.41 ± 0.08 μM（P < 0.05）；原文在此处截断，后续数据未详述
讨论与解读
芽孢杆菌属可形成高度耐热的内生芽孢，能存活于食品加工过程，对熟制食品构成潜在威胁。蜡样芽孢杆菌作为常见食源性病原菌，既引起食品腐败，又产生肠毒素或呕吐毒素 cereulide 导致食物中毒。中国调查显示牛肉中蜡样芽孢杆菌流行率 22.58%，加工肉制品污染率（41.94%）明显高于生肉（24.58%）。本研究从熟牛肉中分离的菌株全部属于芽孢杆菌属，均产蛋白酶，其中蜡样芽孢杆菌致病性更强。芽孢杆菌是巴氏杀菌乳和熟肉制品中的主要腐败菌之一，其芽孢能耐受高温、低 pH、高压等不利条件，一旦条件适宜便萌发为代谢活跃的营养细胞。因此，抑制芽孢向营养细胞转变的策略至关重要。近年来消费者愈发青睐天然抗菌剂，本研究据此评估了 nisin 的作用。
本研究的一个关键发现是 nisin 的阶段特异性：低浓度促进萌发、高浓度阻断出芽。这一"先促后阻"的模式提示 nisin 的抑菌窗口恰好落在萌发启动之后、出芽完成之前，膜损伤、ROS 升高与 ATP 耗竭构成一条连贯的损伤链条。转录组层面 3049 个差异基因及能量代谢、氨基酸生物合成通路的扰动，与表型数据相互印证。熟牛肉实验进一步表明 nisin 能抑制出芽、延缓腐败，具备实际应用潜力。
编译者解读。 从合成生物学视角看，该研究的价值在于把 nisin 的作用节点精确定位到"萌发—出芽"转换期，这为设计芽孢特异的杀灭模块提供了时间窗依据。局限也很明显：MIC 高达 400 µg/mL，远高于食品中常规添加水平，直接套用成本与感官风险都需评估；机制数据多来自群体水平，单细胞异质性未展开。未来或可将 nisin 与萌发诱导剂联用，走"先催后杀"的合成逻辑，以降低有效剂量。
参考来源
期刊：Journal of Food Protection, 2026
DOI: 10.1016/j.jfp.2026.100927
DOI: 10.1016/j.jfp.2026.100927