来源：A chromium whole-cell biosensor based on dual positive feedback amplification with synergizing trace detection and rapid response（Microchemical Journal）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
全细胞生物传感器在污染物生物有效性评估中常受困于输出信号弱、灵敏度低、响应慢三大瓶颈。黄玉元等构建了铬全细胞生物传感器 Cr-luxopt，将 T7 驱动的识别蛋白 ChrB 高表达与 LuxRΔ 介导的自扩增级联整合为双正反馈架构，并采用单诱导剂（IPTG）策略降低代谢负担、通过密码子优化保障遗传稳定性。该传感器在 4 h 内即可响应，线性范围 5–1000 nM，原样检测限低至 1 nM，较 WHO 饮用水安全标准（960 nM）低近三个数量级，并在连续 5 代传代与 90 天超低温冻存后保持定量能力。
研究背景
工业发展使铬及其化合物在冶金、制革、电镀等领域广泛应用，铬污染已成严峻的环境与公共卫生问题。环境中的铬主要以三价 Cr(III) 与六价 Cr(VI) 两种价态存在，Cr(VI) 的毒性比相对稳定、毒性较低的 Cr(III) 高 500–1000 倍。在水环境中，Cr(VI) 主要以铬酸根（CrO₄²⁻）和重铬酸根（Cr₂O₇²⁻）形式存在，其空间构型与硫酸根（SO₄²⁻）、磷酸根（PO₄³⁻）高度相似，可经细胞膜上的硫酸盐转运通道快速进入细胞。胞内蓄积的 Cr(VI) 不仅诱导强烈氧化应激、产生大量活性氧（ROS），还导致蛋白质变性与 DNA 链断裂。因此 Cr(VI) 被国际癌症研究机构（IARC）列为 I 类致癌物。实现水体和土壤中痕量 Cr(VI) 的高效、灵敏、快速监测，对环境保护与公共健康意义深远。然而，尽管高效液相色谱（HPLC）等分析技术已用于污染监测与评估，传统全细胞生物传感器在真实环境痕量污染物原位监测中仍面临输出信号弱、检测限高、检测时间长等障碍。
研究方法
2.1 菌株、试剂与培养条件
质粒构建使用大肠杆菌 DH5α，蛋白表达使用大肠杆菌 BL21(DE3)。细胞在 Luria-Bertani（LB）液体培养基（10 g/L 氯化钠、5 g/L 酵母提取物、10 g/L 蛋白胨，pH 7.2–7.4）中培养，按需添加 50 mg/L 硫酸卡那霉素。固体琼脂平板在上述培养基中加入 1.5 g/L 琼脂制备。所有菌株均在 37 °C、220 rpm orbital 振荡条件下培养。大肠杆菌 DH5α 与 BL21(DE3) 化学感受态细胞、PCR 试剂、限制性内切酶及无缝克隆组装试剂盒购自全式金生物（中国）。CdCl₂、Pb(NO₃)₂、ZnCl₂、HgCl₂、CuCl₂、CrCl₃、K₂Cr₂O₇、硫酸卡那霉素和异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）购自阿拉丁生化科技（中国）。PCR 引物合成与测序由擎科生物（中国）完成。
【数据】培养基：LB（10 g/L NaCl、5 g/L 酵母提取物、10 g/L 蛋白胨，pH 7.2–7.4）；抗生素：50 mg/L 硫酸卡那霉素；琼脂：1.5 g/L；温度：37 °C；转速：220 rpm
2.2 WCB 质粒的构建
以 Cupriavidus metallidurans CH34 的 pMOL28 质粒为模板扩增 P chr 启动子与 chrB 基因编码序列。以 pGN68 质粒为模板扩增 P luxI 启动子与 luxR 基因编码序列。具体而言，pGN68 携带的 luxR 为 N 端截短变体 luxRΔ2–162（缺失第 2–162 位氨基酸），该变体仅保留 C 端 DNA 结合结构域，无需结合酰基高丝氨酸内酯（AHL）即可组成型激活 P luxI 启动子。本研究中统一命名为 luxRΔ。以 pAM1 质粒为模板扩增 mcherry 基因。T7 启动子与 T7 终止子来源于 pET-28a(+)，组成型启动子 P J23100 从 NCBI 数据库获取。以松弛型中拷贝质粒 pET-28a(+) 为载体，构建 Cr(VI) 表达载体 WCB 质粒，包括启动子验证线路（补充图 S1）、由天然启动子 P chr 驱动报告模块的基础 WCB 质粒（Cr-native）、由组合启动子 P 100-chr 驱动的基础 WCB 质粒（Cr-100）以及双正反馈放大 WCB 质粒（Cr-luxopt）（补充图 S2）。具体而言，双正反馈质粒携带的两份 luxRΔ 中，一份经密码子优化并命名为 luxRΔopt，以降低序列同源性、规避同源重组风险。密码子优化由擎科生物（中国）完成，优化前后序列比对见补充图 S3。
【数据】模板质粒：pMOL28、pGN68、pAM1、pET-28a(+)；截短变体：luxRΔ2–162（缺失氨基酸 2–162）；载体：pET-28a(+)（松弛型中拷贝）；启动子：P chr、P luxI、T7、P J23100；报告基因：mcherry；优化对象：一份 luxRΔ（luxRΔopt）
2.3 启动子功能验证
为验证三种不同启动子构建的线路，将相应重组菌株接种于含卡那霉素的 LB 液体培养基，37 °C、220 rpm 过夜振荡活化。随后将过夜培养物以 1%（v/v）接种量转接至装有 10 mL 含卡那霉素 LB 液体培养基的 18 mm × 18 mm 试管中，继续在 37 °C、220 rpm 下培养。于培养 4、8、24 h 时从各管取 200 μL 样品，转移至 96 孔板，用酶标仪（Varioskan LUX，Thermo Fisher Scientific，美国）测定光密度（OD600）与相对荧光单位（RFU）。
【数据】接种量：1%（v/v）；培养基体积：10 mL；试管规格：18 mm × 18 mm；取样体积：200 μL；取样时间点：4、8、24 h；温度：37 °C；转速：220 rpm；仪器：Varioskan LUX 酶标仪
2.4 基础传感器 Cr-native 与 Cr-100 的荧光响应测定
将基础菌株 WCB Cr-native 与 Cr-100 接种于含卡那霉素的 LB 液体培养基，37 °C、220 rpm 过夜培养活化。随后以 1%（v/v）接种量转接至装有 10 mL 含卡那霉素 LB 液体培养基的 18 mm × 18 mm 试管，继续 37 °C、220 rpm 培养。当培养物 OD600 达到约 0.6 时，用 1 M 与 100 mM IPTG 母液向试管中加入不同体积 IPTG，使终浓度分别为 40、100、400 和 1000 μM。同时设置 Cr(VI) 终浓度为 0、0.001、0.01、0.1、1、10 和 100 nM 的实验组。诱导培养维持 24 h，于 4、8、12 和 24 h 取样。用酶标仪测定各时间点样品的 RFU。
【数据】诱导起始 OD600：约 0.6；IPTG 终浓度：40、100、400、1000 μM；IPTG 母液：1 M、100 mM；Cr(VI) 终浓度：0、0.001、0.01、0.1、1、10、100 nM；诱导时长：24 h；取样时间点：4、8、12、24 h；接种量：1%（v/v）；培养基体积：10 mL；温度：37 °C；转速：220 rpm
2.5 双正反馈传感器 Cr-luxopt 的荧光响应测定
诱导前菌株的培养与取样操作同 2.4。随后加入不同体积 IPTG（来自 1 M 与 100 mM 母液），使终浓度分别为 0.04、0.1、0.4、0.6、0.8、1.0、1.4、1.6、1.8 和 2.0 mM。同时设置 Cr(VI) 终浓度为 0、0.0001、0.001、0.005、0.01、0.05、0.1、0.5、1、5、10 和 100 nM 的实验组。诱导持续 8 h，每 2 h 取样一次。用酶标仪记录各样品 RFU。
【数据】IPTG 终浓度：0.04、0.1、0.4、0.6、0.8、1.0、1.4、1.6、1.8、2.0 mM；IPTG 母液：1 M、100 mM；Cr(VI) 终浓度：0、0.0001、0.001、0.005、0.01、0.05、0.1、0.5、1、5、10、100 nM；诱导时长：8 h；取样间隔：2 h；接种量：1%（v/v）；温度：37 °C；转速：220 rpm
2.6 剂量-响应曲线的非线性拟合与动力学参数提取
本研究采用非线性回归模型拟合不同传感器的剂量-响应数据并提取动力学参数，全部拟合过程使用 GraphPad Prism 10 软件执行。Hill 方程最初用于阐明氧气与血红蛋白的协同结合，现广泛用于定量合成生物学遗传网络中转录因子与配体或 DNA 的结合特征。考虑到本研究中两类传感器拓扑结构差异，采用不同模型方程拟合。对于基础传感器 Cr-100，因其天然启动子调控系统缺乏信号放大机制、靶标结合符合非协同特征，采用 Hill 系数固定（n = 1）的三参数激活型 Hill 方程拟合：Y = F min + (F max − F min)/(1 + EC 50/X)。对于双正反馈放大传感器 Cr-luxopt，鉴于 LuxRΔ 正反馈环路通常触发非线性信号级联放大，采用变斜率的四参数 Hill 方程：Y = F min + (F max − F min)/(1 + EC 50/X n)。上述方程中，Y 表示系统输出的相对荧光单位（AFU）；X 表示靶离子 Cr(VI) 的终浓度；Fmin 表示无靶标时的基础荧光泄漏；Fmax 表示系统被靶标饱和激活时的最大荧光输出。在系统动力学中，Fmax 的理论上限从根本上受启动子固有最大转录速率（Vmax）与 RNA 聚合酶招募效率约束。EC50 为半数最大效应浓度，是评估传感器灵敏度的核心指标。参数 n 为 Hill 系数，反映系统响应过程中的协同效应。通过比较拟合得到的 Fmax、EC50 与 n 值，可在分子动力学层面精确量化遗传线路优化对痕量检测性能提升的贡献。
【数据】拟合软件：GraphPad Prism 10；Cr-100 模型：三参数 Hill 方程（n 固定为 1）；Cr-luxopt 模型：四参数变斜率 Hill 方程；参数：Fmin、Fmax、EC50、n；输出单位：AFU
2.7 特异性测试与干扰测试
特异性测试：在 IPTG 终浓度 1 mM 条件下评估 WCB Cr-luxopt 菌株对多种重金属离子的荧光响应。测试金属离子包括 Cr³⁺、Cu²⁺、Zn²⁺、Cd²⁺、Hg²⁺ 和 Pb²⁺，所有离子的终浓度梯度设为 0、0.001、0.01、0.1、1 和 10 nM。金属离子与 IPTG 的添加方式与前文一致。诱导培养 4 h 后取样，测定各条件下的相对荧光单位（RFU）。干扰测试：为评估传感器的抗干扰能力，将干扰金属离子混合物……（原文此处节选不完整，后续内容未详述）。
【数据】IPTG 终浓度：1 mM；测试离子：Cr³⁺、Cu²⁺、Zn²⁺、Cd²⁺、Hg²⁺、Pb²⁺；离子浓度梯度：0、0.001、0.01、0.1、1、10 nM；诱导时间：4 h；检测指标：RFU
研究结果
3.1 组合启动子的构建与验证
为筛选兼具最佳转录驱动能力与特异性的启动子模块，设计并构建了三个启动子验证线路，如图 1A 所示。其中，由组成型启动子 P J23100 驱动红色荧光蛋白 mCherry 表达的线路命名为 Basic，作为定量评估天然 P chr 启动子与组合启动子 P J23100-P chr 活性的标准强度参照。组合启动子线路命名为 P 100-chr。时间-荧光表征结果如图 1B 所示。三种启动子驱动的荧光信号均随培养时间持续累积上升。其中 Basic 线路在所有时间点保持最高表达水平。天然单启动子 P chr 驱动的线路在 24 h 培养期间荧光增长缓慢，而组合启动子 P 100-chr 在 24 h 的荧光强度约为天然单启动子的 4.5 倍。分析表明，天然 P chr 启动子虽有一定表达水平，但整体信号强度有限，难以满足痕量检测的灵敏度需求；组合启动子 P 100-chr 驱动的线路整体荧光输出大幅提升。然而对诱导型全细胞生物传感器而言，P 100-chr 在增强靶标信号的同时，可能同步抬高无 Cr(VI) 时的背景泄漏，从而削弱信噪比。因此本研究将天然启动子 P chr 与组合启动子 P 100-chr 分别进一步整合进完整传感调控线路，评估启动子架构对传感性能的综合影响。
【数据】启动子：P J23100、P chr、P J23100-P chr（P 100-chr）；报告基因：mCherry；培养时间：24 h；荧光倍数：P 100-chr 24 h 荧光约为天然 P chr 的 4.5 倍；取样时间点：4、8、24 h
3.2 基础传感器 Cr-native 与 Cr-100 的构建与比较表征
本研究构建了天然启动子驱动的传感线路（Cr-native）与基于组合启动子的基础传感器（Cr-100），如图 1C 所示。二者均依赖受 IPTG 经 T7 启动子调控的特异性识别蛋白 ChrBopt，对报告模块进行负调控。无 Cr(VI) 时，ChrBopt 通过结合操纵序列紧密阻遏启动子。Cr(VI) 进入胞内后与 ChrBopt 结合，触发别构转变、解除空间阻遏并激活报告基因转录。因此传感器输出受双重调控：IPTG 调节胞内受体丰度，Cr(VI) 触发特异性信号级联。为系统评估性能差异，在不同 IPTG 与 Cr(VI) 浓度组合下对两种传感器进行表征，如图 1D 所示。Cr-native 的信号输出严重受限。在 0.4 mM IPTG 诱导、12 h 条件下，其对原水样的实际检测限（LOD）仅为 10 μM。尽管将 IPTG 降至 0.1 mM 并延长培养至 24 h 最终可将 LOD 改善至 10 nM，但这种迟缓响应使其不适合快速环境监测。相比之下，基础传感器 Cr-100 显著加快了响应动力学，却难以同时兼顾灵敏度与定量准确性。在 0.4 mM IPTG 下，Cr-100 在短短 12 h 内即成功实现 10 nM 的痕量 LOD。然而强 P 100-chr 启动子同时放大了未诱导的基础泄漏，使信噪比降至 1.56。这种升高的背景噪声严重破坏浓度依赖性，导致无法进行可靠的非线性剂量-响应曲线拟合。为恢复定量模型拟合，必须将 IPTG 诱导降至 0.1 mM，得到 EC50 约为 0.01 μM（补充表 S2）。但这一调整牺牲了检测能力，使 12 h LOD 回落至 1 μM。此外，最大饱和荧光输出仍从根本上受组合启动子固有最大转录速率瓶颈制约。综上，天然启动子与组合启动子均无法解决痕量 LOD 与可靠定量拟合之间不可调和的矛盾。这 necessitated 引入自增强正反馈级联放大模块，以同时突破检测限、定量可靠性与响应时间的三重约束。
【数据】菌株：Cr-native、Cr-100；识别蛋白：ChrBopt；诱导剂：IPTG；Cr-native LOD：0.4 mM IPTG/12 h 为 10 μM，0.1 mM IPTG/24 h 为 10 nM；Cr-100 LOD：0.4 mM IPTG/12 h 为 10 nM；Cr-100 信噪比：1.56（0.4 mM IPTG）；Cr-100 EC50：约 0.01 μM（0.1 mM IPTG）；Cr-100 12 h LOD（0.1 mM IPTG）：1 μM
3.3 密码子优化双正反馈传感器 Cr-luxopt 的构建与 IPTG 诱导梯度的系统优化
为进一步放大响应强度与痕量检测能力，将 LuxRΔ 介导的正反馈模块整合进 Cr-100，得到双反馈传感器 Cr-luxopt（图 2A）。该架构中，IPTG 诱导的 P t7 驱动 ChrBopt 高表达以增强 Cr(VI) 识别，P 100-chr 与 P luxI 启动子共同驱动 LuxRΔ 介导的自扩增级联。这种单诱导剂策略显著避免了多诱导剂系统常见的严重代谢负担。此外，对一份 luxRΔ 拷贝进行密码子优化（CAI 从 0.61 提升至 0.79，补充图 S3），成功规避同源重组，从结构上保障了遗传线路。为确定最佳工作条件，在 2 至 8 h 内跨宽 IPTG 梯度（0.04 至 2.0 mM）表征 Cr-luxopt 对 Cr(VI) 的动态响应，如图 2B 热图所示。2 h 时系统在所有 IPTG 浓度下几乎无响应，主要归因于受体与报告蛋白转录、翻译及累积所需的动力学延迟（图 3A）。4 h 时出现明显不同的响应谱。低浓度组（0.04、0.1、0.4 mM）与高浓度组（1.6、1.8、2.0 mM）基本无响应，信噪比停滞在 1.0 附近（图 3B）。前者缺乏足够的 ChrB 与 LuxR 启动级联，后者则因过度诱导引发的资源竞争与代谢应激而无法产生有效响应。0.6 mM 组表现出 Cr(VI) 响应，但其基础泄漏明显高于 1.0 mM 组，导致信噪比下降、浓度依赖性较差。这表明 0.6 mM 时 ChrB 丰度不足以紧密阻遏 P 100-chr 启动子，导致背景泄漏的非特异性触发。有趣的是，0.8 mM 组完全丧失响应特征，可能代表基础阻遏与级联激活动力学严重失配的不稳定过渡态。同样，1.4 mM 组显示背景泄漏升高、信噪比恶化，标志过度诱导应激下阻遏失效的开始。最终，仅 1.0 mM IPTG 组表现出最佳协同调控（图 3A）：维持最低基础泄漏，同时呈现完美的浓度依赖响应梯度，峰值信噪比达 3.15（图 3B）。在该诱导点，ChrB 丰度被调节至既能紧密阻遏基础背景，又能在 Cr(VI) 暴露时最大化靶标捕获与级联放大。培养延长至 6–8 h 时，系统普遍出现荧光泄漏，信噪比骤降至 1.11–1.86（图 3A 与 B）。这反映持续正反馈环路随时间累积背景噪声的固有缺陷。因此，1.0 mM IPTG 诱导 4 h 为理想条件……（原文此处节选不完整，后续内容未详述）。
【数据】菌株：Cr-luxopt；密码子优化：CAI 从 0.61 提升至 0.79；IPTG 梯度：0.04–2.0 mM；时间范围：2–8 h；最佳条件：1.0 mM IPTG、4 h；峰值信噪比：3.15；6–8 h 信噪比：1.11–1.86；无响应组信噪比：约 1.0；0.6 mM 组背景泄漏高于 1.0 mM 组
（注：原文结果部分节选至 3.3 末，3.4 及以后内容未提供，故不译。）
讨论与解读
全细胞生物传感器在生物有效性评估与生态风险预警中具有不可替代的优势。尽管已针对金属离子检测改造出大量 WCB，但基于单一天然响应元件的传统 WCB 在应对真实环境痕量污染物原位监测需求时，仍面临输出信号弱、检测限高、检测时间长等障碍。为突破灵敏度与响应时间的约束，引入合成生物学遗传放大线路已成为有力策略。然而，当多种遗传反馈环路放大系统灵敏度时，其效力往往取决于遗传背景与调控元件之间的相互作用。这在实施正反馈系统时尤为突出——正反馈通常伴随背景泄漏升高，不仅可能产生严重假阳性信号，还极易给宿主细胞带来代谢负担。本研究通过构建基于 LuxR 与 ChrB 的双正反馈放大线路，创制了新型铬生物传感器 Cr-luxopt。实验数据与动力学模拟共同证实，该系统在大幅放大检测灵敏度的同时，成功化解了高强度信号输出与……（原文此处节选不完整，后续内容未详述）之间的平衡难题。
编译者解读：该研究的巧思在于用单诱导剂 IPTG 同时调控识别端（ChrB）与放大端（LuxRΔ），把"输入增强"和"输出级联"装进一个可调旋钮，避免了多诱导剂系统的代谢互扰。密码子去同源化处理两份 luxRΔ 拷贝，是针对正反馈线路遗传不稳定的务实解法。局限同样明显：正反馈固有的背景泄漏使最佳信噪比仅 3.15，且 6–8 h 后信号即告漂移，说明该架构更适合短时程快速筛查而非长期在线监测；真实水体中的基质效应与现场部署验证仍是待补的一环。
参考来源
期刊：Microchemical Journal, 2026
DOI: 10.1016/j.microc.2026.120226
DOI: 10.1016/j.microc.2026.120226