来源：Mechanism-guided engineering of production-level-tailored biosensors for high-throughput screening of L-serine producers（Bioresource Technology）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
转录因子类生物传感器的传感性能不足，常限制其在微生物菌株工程中的应用。本研究以LysR型调控因子SerR为模型，建立了一套机制导向的策略，将生物传感器性能定制到不同的L-丝氨酸生产水平。野生型传感器检测限为71.61 mM、动态范围仅2.4倍；经机制解析与理性改造获得两个变体：低滴度筛选版E223V将检测限降至29.82 mM，高滴度分选版N4N0将动态范围扩大至146.2倍。两类传感器分别用于大肠杆菌与谷氨酸棒杆菌的FACS分选，单轮ARTP诱变即获得滴度提高1.7倍至4.15 g/L的菌株，适应性进化后单轮分选使滴度从40.10 g/L提高22%。
研究背景
在合成生物学领域，转录因子类生物传感器（TFBs）已成为高通量筛选（HTS）与微生物细胞工厂适应性进化不可或缺的工具，可高效优化代谢物产量。在各类传感器架构中，采用LysR型转录调控因子（LTTRs）的传感器因天然模块化特性和该蛋白家族的广泛多样性而颇具前景。LTTRs是细菌转录调控因子中最大的家族之一，为合成线路设计提供了丰富资源，已在适应性进化、代谢物动态监测和HTS中得到应用。
然而，天然LTTR类生物传感器——包括源自谷氨酸棒杆菌（C. glutamicum）SerR的L-丝氨酸传感器——常表现出检测范围窄、灵敏度欠佳、响应动力学慢等限制，阻碍实际应用。已有多种工程策略被开发以突破这些约束，其中一类策略聚焦于改造转录因子（TF）本身的特性，尤其是配体结合结构域。本研究以SerR为模型，先解析其调控机制，再据此定制传感器性能，使之匹配不同生产水平的筛选需求。
研究方法
2.1 通用材料
酶、试剂盒和引物分别购自Vazyme、BSGZ、ThermoFisher和Exsyn Bio。DNA/质粒试剂盒及化学品购自YEASEN、Merck和Sangon。质粒由Talen Bio完成测序。
【数据】试剂供应商：Vazyme、BSGZ、ThermoFisher、Exsyn Bio、YEASEN、Merck、Sangon；测序服务商：Talen Bio；原文未详述具体用量与反应条件
2.2 质粒构建
表S1列出了本研究使用的全部引物和质粒。下文所述关键质粒的构建方式如下：1）pDsereGFP：生物传感器以合成DNA片段为骨架搭建。2）pDsereGFP-promoters-serR：通过Golden Gate组装（Engler et al., 2008）用七个启动子替换P serR。3）pDsereGFP-RBS serE -serR-RBS serR ：通过定点突变将天然RBS替换为合成RBS（如RBS1、RBS4）。命名遵循"N_N_"格式，其中"0"表示初始RBS，第一项对应serE的RBS，第二项对应serR的RBS。详见方法S1。所有构建体均经测序验证。
【数据】启动子数量：7个；RBS变体：RBS1、RBS4等；组装方法：Golden Gate；突变方法：定点突变；原文未详述DNA片段用量与反应体积
2.3 菌株构建
产L-丝氨酸的大肠杆菌菌株4WG（W3110ΔtdcGΔsdaAΔsdaBΔglyA serA dr）与谷氨酸棒杆菌菌株A均由本实验室构建。谷氨酸棒杆菌菌株A由菌株A36衍生而来，方法是将天然serA启动子替换为更强的启动子。用于FACS筛选时，菌株4WG与菌株A分别转入生物传感器质粒pDsereGFPP trc -E223V和pDsereGFPP trc -N4N0，得到菌株4WGB与AB。亲本菌株的详细基因型见表S1。大肠杆菌在LB培养基中37℃培养，谷氨酸棒杆菌在BHI培养基中30℃培养，所用抗生素为卡那霉素（50 μg/mL）或氯霉素（40 μg/mL）。
【数据】菌株：E. coli 4WG（W3110ΔtdcGΔsdaAΔsdaBΔglyA serA dr）、C. glutamicum A（A36衍生）、4WGB、AB；培养基：LB（大肠杆菌）、BHI（谷氨酸棒杆菌）；温度：37℃（大肠杆菌）、30℃（谷氨酸棒杆菌）；抗生素：卡那霉素50 μg/mL、氯霉素40 μg/mL
2.4 生物传感器测定
携带生物传感器质粒的大肠杆菌JM109在含卡那霉素的LB培养基中培养。细胞在96孔板中以1–100 mM L-丝氨酸诱导，37℃培养5 h。谷氨酸棒杆菌在BHI培养基中培养，同样条件下于30℃诱导5 h。OD（大肠杆菌OD600、谷氨酸棒杆菌OD562）与荧光（Ex/Em：488/509 nm）用BioTek Synergy H4酶标仪测定，增益保持170。荧光读数先扣除PBS空白的荧光与OD值，再对OD归一化。尽管各变体分批测定，所有批次均采用相同的诱导与测定条件。每个实验做三个生物学重复。
【数据】诱导剂浓度：1–100 mM L-丝氨酸；温度：37℃（大肠杆菌）、30℃（谷氨酸棒杆菌）；时间：5 h；检测波长：Ex/Em 488/509 nm；增益：170；重复数：3个生物学重复；孔板：96孔板
2.5 数据分析
剂量–响应曲线在GraphPad Prism 10中按下式拟合：a.u. = Bottom + (Top − Bottom)/(1 + (L-serine/EC50)^p)。由拟合曲线导出半数有效浓度（EC50）、Hill斜率（p）、检测限（LOD）和动态范围。动态范围（倍数变化）按下式计算：Dynamic range = Top/Bottom。LOD定义为荧光阈值为Bottom + 3σ时所对应的L-丝氨酸浓度，其中σ为十个空白重复的标准差，由拟合的剂量–响应曲线导出。详见注释S1。
【数据】拟合软件：GraphPad Prism 10；LOD阈值：Bottom + 3σ；空白重复数：10；统计参数：EC50、Hill斜率p、动态范围Top/Bottom
2.6 SerR饱和突变文库构建
针对SerR残基L56、E124、S126和E223的突变文库通过In-Fusion克隆（Clonexpress Kit）构建，引物编码简并密码子（表S1）。文库转化入大肠杆菌JM109，每个文库测序30个随机菌落以确认可行性。
【数据】突变位点：L56、E124、S126、E223；克隆方法：In-Fusion（Clonexpress Kit）；验证：每文库测序30个菌落
2.7 ARTP诱变
取OD600 = 0.6–0.8的4WG菌株，用ARTP处理（100 W，10 SLM，0–150 s）。
【数据】菌体浓度：OD600 0.6–0.8；ARTP功率：100 W；气流量：10 SLM；处理时间：0–150 s
2.8 分析与统计
L-丝氨酸浓度经衍生化后用HPLC测定（Eggeling & Sahm, 2003）。数据用GraphPad Prism 10和OriginPro 2016分析。流式细胞术在BD FACSAriaIII上进行，数据用FlowJo处理。结果以平均值±标准差表示。统计学显著性采用双因素方差分析（P < 0.0332，P < 0.0021，P < 0.0002，****P < 0.0001）。
【数据】HPLC：衍生化法测L-丝氨酸；分析软件：GraphPad Prism 10、OriginPro 2016；流式仪：BD FACSAriaIII；统计方法：双因素方差分析；显著性阈值：P < 0.0332、P < 0.0021、P < 0.0002、****P < 0.0001
研究结果
3.1 SerR介导的L-丝氨酸生物传感器pDser的表征
前期工作利用源自谷氨酸棒杆菌的L-丝氨酸响应调控因子SerR构建了L-丝氨酸生物传感器pDser（Zhang et al., 2018）。尽管pDser已在若干研究中应用，但其筛选效率低，降低了其分离突变体的效用。原始传感器性能欠佳限制了其在高通量筛选中的使用。因此，本研究旨在阐明SerR的调控机制并提升SerR类生物传感器的性能。首先在大肠杆菌中表征pDser的L-丝氨酸响应，所得剂量–响应曲线用Hill方程拟合（图1a）。在检测范围内荧光强度随L-丝氨酸浓度升高而增加。相应性能参数汇总于表1。传感器的灵敏度（以LOD表征）较差，pDser为71.61 mM；动态范围限于2.4倍。Hill斜率高达45.21，对应检测范围仅71.61–78.93 mM，提示剂量–响应曲线存在极强的协同性。因此，pDser仅适合定性检测L-丝氨酸的有无，无法在宽浓度范围内定量测定。
【数据】LOD：71.61 mM；动态范围：2.4倍；Hill斜率：45.21；检测范围：71.61–78.93 mM；菌株：E. coli（pDser）
3.2 L-丝氨酸感应转录因子SerR调控机制的解析
要有效优化pDser的灵敏度（LOD）与动态范围，必须研究SerR的调控机制。迄今研究仅报道胞内L-丝氨酸诱导SerR介导其同源基因serE（编码L-丝氨酸外排蛋白SerE）的激活（Binder et al., 2012; Zhang et al., 2020）。但SerR是否直接与L-丝氨酸及其同源启动子相互作用、属于何种转录因子、如何调控serE表达，仍不清楚。于是用NCBI资源分析SerR蛋白序列，结果显示SerR属于LTTR家族。LTTR的经典调控机制以"滑动二聚体"模型描述（Maddocks & Oyston, 2008）。通常LTTR形成二聚体作为DNA结合的功能单元，经配体诱导的构象变化减少DNA弯曲并调控下游基因表达（Alanazi et al., 2013; van Keulen et al., 2003）。但该模型存在例外，如CysB样调控因子Cbl即为典型例子（Pokhrel et al., 2023; Sainsbury et al., 2009; Stec et al., 2006）。可见即使在LTTR家族内部，调控机制也可能偏离经典模型。因此，解析SerR的精确机制对进一步精细调控传感器至关重要。
首先用EMSA研究SerR与P serE基因区域的相互作用。SerR蛋白在大肠杆菌BL21（DE3）中过表达，经镍螯合层析纯化，平均分子量为35 kDa（图1b）。随后进行EMSA分析（方法S3）。如图1c所示，泳道1仅含DNA探针（阴性对照），无条带迁移。随着纯化SerR浓度从0增至70 ng（泳道2–6），DNA–蛋白复合物形成逐步增加。SerR达70 ng时游离探针条带完全消失（泳道7），表明结合完全饱和。这些结果证实SerR与P serE区域之间存在直接、剂量依赖的相互作用。
为检验L-丝氨酸是否调节SerR的DNA结合活性，在有、无L-丝氨酸条件下进行对比EMSA。两种条件下加入SerR均使游离P serE DNA条带消失；apo态与配体结合态SerR在SerR–P serE复合物迁移率或结合亲和力上未见明显差异（图S1）。这表明无论L-丝氨酸存在与否，SerR均保持结合于靶启动子P serE。
接着用等温滴定量热法（ITC）定量SerR与L-丝氨酸的结合（图1d）。结合常数K = 3.30 M⁻¹，表明结合亲和力低。反应为吸热（ΔH = 2.743 × 10⁵ cal/mol），并伴随较大的正熵变（ΔS = 922 cal/mol/deg），提示疏水相互作用是结合的主要驱动力。这些结果证实L-丝氨酸直接结合SerR。弱亲和力与pDser传感器观察到的较差灵敏度（LOD约71.61 mM）一致。
随后通过双质粒系统验证配体L-丝氨酸对调控的影响（图1e）。使用两个质粒：质粒P1携带P serE区域和egfp报告基因，质粒P2仅表达SerR。仅存在P1时荧光报告系统处于"OFF"状态；共转入P1与P2也未能激活系统。只有P1、P2与L-丝氨酸三者共存时系统才被激活，表明SerR对P serE的调控依赖L-丝氨酸的存在。本质上，SerR、P serE与L-丝氨酸同时参与才能调控转录。
最后，为表征SerR的寡聚状态并研究其对L-丝氨酸的响应，进行戊二醛交联（图1f，方法S4）。更换表达载体并引入N端和C端His标签以减少纯化时的包涵体形成，这些改造使SerR表观分子量略增至约40 kDa。未交联时SerR主要以单体迁移（泳道1–4）。无DNA时交联产生单体、二聚体和四聚体条带（泳道5）。存在P serE DNA时四聚体条带更明显，单体与二聚体条带仍可检出（泳道6），提示DNA结合有利于形成或稳定可交联的SerR四聚体。随L-丝氨酸浓度升高（10–100 mM），四聚体信号逐步减弱，单体信号增加，二聚体条带相对稳定（泳道7–12）。这些结果提示L-丝氨酸改变了可交联SerR寡聚体的分布，与配体依赖的SerR亚基组织变化一致。
此外，用网站（https://www.fruitfly.org/seq_tools/promoter.html）分别预测了P serR与P serE启动子的−35和−10区，结果见图1g。基因组结构导致SerR与其靶基因serE呈发散转录。转录因子结合位点横跨P serR与P serE两个启动子，这阻碍了对关键元件的精细调控。
传感器特异性用一组结构相关代谢物评估。构建L-丝氨酸类似物文库，并按对SerR的预测结合亲和力排序，从中选取排名靠前的L-半胱氨酸和β-丙氨酸。二者均未引起相对荧光的显著变化（图S2a）。进一步测定L-苏氨酸、甘氨酸、L-丙氨酸和D-丝氨酸，其中仅D-丝氨酸引起相对荧光的浓度依赖性升高（图S2b）。由于D-丝氨酸在本培养条件下并非普遍存在的代谢中间体，该交叉反应不太可能干扰传感器在筛选优良L-丝氨酸生产菌中的实际应用。
基于上述结果，SerR的调控机制如图1h所示。SerR结合P serE启动子，L-丝氨酸诱导SerR寡聚体分布发生剂量依赖性变化。
【数据】SerR分子量：35 kDa（纯化后）、约40 kDa（双His标签后）；EMSA：SerR 0–70 ng，70 ng时结合饱和；ITC：K = 3.30 M⁻¹，ΔH = 2.743 × 10⁵ cal/mol，ΔS = 922 cal/mol/deg；交联：L-丝氨酸10–100 mM；LOD：约71.61 mM；测试类似物：L-半胱氨酸、β-丙氨酸、L-苏氨酸、甘氨酸、L-丙氨酸、D-丝氨酸
讨论与解读
野生型L-丝氨酸生物传感器pDser的传感窗口有限：灵敏度差（LOD 71.61 mM）、动态范围窄（2.4倍）。机制分析表明，SerR–L-丝氨酸–P serE复合物介导的转录激活在L-丝氨酸达到71.61 mM阈值时被触发。基于该机制认识，作者构建了模块化SerR类传感器并理性调节其传感特性：pDsereGFPP trc -E223V变体改善灵敏度，LOD降至29.82 mM；pDsereGFPP trc -N4N0变体将动态范围扩大至146.2倍，较野生型提高60.9倍。通过将传感特性匹配到不同生产窗口，工程化传感器实现了在大肠杆菌和谷氨酸棒杆菌低、高滴度背景下基于FACS的有效富集。该工作确立了"按生产水平定制传感器性能"的机制导向原则，用于传感器工程与微生物菌株开发。
编译者解读：本研究的方法学价值在于"先机制、后改造"的顺序：先用EMSA、ITC与交联实验确认SerR直接结合L-丝氨酸且配体改变其寡聚态，再把LOD与动态范围作为两个可独立调节的参数分头优化——低滴度场景要低LOD，高滴度场景要大动态范围。这种"按生产窗口定制"的思路比追求单一"最优传感器"更贴近工业筛选实际。局限在于两个变体仍分属不同质粒、需分别使用，且D-丝氨酸交叉反应虽被论证为不干扰，却提示配体特异性仍有改造空间。
参考来源
期刊：Bioresource Technology, 2026
DOI: 10.1016/j.biortech.2026.136251
DOI: 10.1016/j.biortech.2026.136251