来源：Intensified β-glucan biosynthesis by Aureobasidium melanogenum via an inert carrier-assisted fermentation system（Biochemical Engineering Journal）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
黑酵母（Aureobasidium melanogenum）分泌的β-葡聚糖具有β-1,3主链与β-1,6分支的独特结构，生物活性优异。本研究构建惰性载体辅助发酵系统（ICFS），从农业副产物与工业材料中筛选载体，最终确定20目活性炭为最优载体，β-葡聚糖产量较游离细胞体系提高40.19%。扫描电镜、酶活与转录组分析揭示载体通过调控碳代谢通路与关键合成酶活性促进产物积累，重复批次发酵验证了系统稳定性。
研究背景
β-葡聚糖是广泛分布于植物组织与微生物细胞中的天然多糖，具有多种生物活性，因生物安全性好、功能多样，已获美国FDA批准用作食品添加剂与营养保健品成分。在众多微生物生产者中，Aureobasidium spp. 能胞外分泌β-葡聚糖，下游分离纯化便利，在工业规模生产上具备成本优势。其β-葡聚糖结构独特——主链经β-1,3-糖苷键连接，侧链通过β-1,6-糖苷键高度分支，这一结构赋予其较强的免疫刺激活性与良好的毒理学特征，有望成为食品添加剂与药物功能原料。
迄今针对出芽短梗霉产β-葡聚糖的研究，多集中于菌种选育与发酵参数优化。但实际生产仍存在若干难题，包括与普鲁兰多糖的共合成等问题。本研究即在此背景下提出惰性载体辅助发酵策略，以期强化β-葡聚糖合成。
研究方法
2.1 材料
活性炭购自郑州中辽环保科技有限公司（中国郑州），聚丙烯材料购自东莞市华创塑胶化工有限公司（中国东莞），聚氨酯泡沫购自昆山亿杰灵电子科技有限公司（中国昆山）。微生物培养基质方面，蛋白胨、琼脂与酵母提取物粉购自奥博星生物技术有限公司（中国北京），马铃薯浸粉购自四川宝顺生物技术有限公司（中国南充）。农业副产物中，玉米芯与麦秸由林口县惠丰秸秆有限公司（中国牡丹江）供应；麦麸购自河北平朔贸易有限公司（中国石家庄）；米糠购自吴江金娟饲料店（中国吴川）；黑麦麸购自嘉田粮店（中国菏泽）；丝瓜络由广西品磊农业发展有限公司（中国南宁）提供。本工作所用化学试剂均为分析纯，购自国药集团化学试剂有限公司（中国上海）。本工作未测定比表面积、平均孔径、孔隙率等定量物理参数；表S0所列参数为郑州中辽环保科技有限公司提供的产品技术数据。载体评价依据发酵性能并结合SEM微观形貌定性观察进行。
【数据】载体投加浓度：10 g/L；物理参数：比表面积、平均孔径、孔隙率原文未详述（未测定）
2.2 菌株与培养条件
本研究所用菌株 A. melanogenum CGMCC No. 18996保藏于中国科学院微生物研究所中国普通微生物菌种保藏管理中心（CGMCC）。菌种保藏培养物保存于4 °C的PDA斜面。一级种子培养基含20.0 g/L葡萄糖与12.0 g/L马铃薯浸粉（自然pH），二级种子培养基添加20.0 g/L葡萄糖与15.0 g/L马铃薯浸粉（自然pH）。二级种子液在接种至发酵培养基前达到OD₆₀₀ = 15.8 ± 0.3。发酵培养基含50.0 g/L葡萄糖、3.0 g/L酵母提取物、0.6 g/L (NH₄)₂SO₄、2.0 g/L K₂HPO₄、0.2 g/L MgSO₄·7H₂O、1.0 g/L NaCl与0.1 g/L ZnSO₄。
冷藏斜面培养物在28 °C活化2 h后，接种至装液量100 mL一级种子培养基的500 mL三角瓶中，28 °C、200 rpm培养24 h。随后按10%（v/v）将一级种子液转接至二级种子培养基，相同振荡条件下再培养24 h。在挡板摇瓶中，按10%（v/v）将成熟二级种子液接种至100 mL无菌发酵培养基，28 °C、180 rpm培养，72 h后结束发酵。
放大发酵在5 L发酵罐（B10TECH-5JG，宝兴赛斯制药设备（上海）有限公司，中国）中进行，装液量3 L无菌发酵培养基。按10%（v/v）接种二级种子后，于28 °C、600 r/min搅拌转速、1 vvm通气量下发酵72 h，pH稳定在6.0。所有操作均在无菌条件下进行：摇瓶以纱布与牛皮纸封口，发酵罐按标准规程灭菌。细胞固定化在发酵过程中原位完成：载体与发酵培养基一同灭菌后再接种。ICFS中游离悬浮细胞与载体吸附的固定化细胞共存，总生物量定量包含两部分（见2.4节），以评估两类细胞群体的贡献。
重复批次培养的具体实验步骤为：用接种环将培养良好的A. melanogenum斜面培养物接种至一级种子培养基，28 °C、180 rpm振荡培养24 h；随后按10%（v/v）接种比将培养液接种至二级种子培养基，相同条件下再培养24 h；再将二级种子培养液按10%（v/v）接种量接入生物反应器，总工作体积3 L。如上所述，装入钢丝网罩的活性炭固定于发酵罐内部。初始发酵72 h后启动重复批次发酵：经取样口排出发酵废液，补入灭菌新鲜培养基；后续培养程序与第一批次一致，每个发酵周期设定为72 h，连续重复三批次。
【数据】菌株：A. melanogenum CGMCC No. 18996；一级种子：20.0 g/L葡萄糖、12.0 g/L马铃薯浸粉；二级种子：20.0 g/L葡萄糖、15.0 g/L马铃薯浸粉；接种OD₆₀₀：15.8 ± 0.3；发酵培养基：50.0 g/L葡萄糖、3.0 g/L酵母提取物、0.6 g/L (NH₄)₂SO₄、2.0 g/L K₂HPO₄、0.2 g/L MgSO₄·7H₂O、1.0 g/L NaCl、0.1 g/L ZnSO₄；活化：28 °C、2 h；一级种子培养：28 °C、200 rpm、24 h；二级种子培养：28 °C、200 rpm、24 h；摇瓶发酵：28 °C、180 rpm、72 h；发酵罐：5 L罐、装液3 L、28 °C、600 r/min、1 vvm、pH 6.0、72 h；接种量：10%（v/v）；重复批次：3批、每批72 h
2.3 惰性载体的预处理方法
（1）丝瓜络：切成1 cm×1 cm×1 cm方块，随后预处理；（2）网状聚酯纤维：切成1 cm×1 cm×1 cm方块，随后预处理；（3）麦麸：用植物组织粉碎机粉碎，过不同目数筛网（10–80目），随后预处理；（4）其他类型载体：不经粉碎或切割，直接预处理。
惰性载体通用预处理流程：载体煮沸10–20 min，用去离子水冲洗1–5次，以去除可能干扰发酵过程的固有成分；随后将处理后的载体于60–70 °C烘箱中干燥12 h。细胞固定化前，干燥载体与发酵培养基一同于121 °C灭菌20 min。
【数据】丝瓜络/聚酯纤维尺寸：1 cm×1 cm×1 cm；麦麸筛分：10–80目；煮沸：10–20 min；冲洗：去离子水1–5次；干燥：60–70 °C、12 h；灭菌：121 °C、20 min
2.4 分析方法
A. melanogenum合成的β-葡聚糖在发酵液中完全水溶，从而避免β-1,3–1,6-葡聚糖等不溶性多糖的干扰。β-葡聚糖含量、细胞生物量与总糖（包括β-葡聚糖、普鲁兰与未鉴定的杂多糖）的定量按Chen等[14]建立的方案执行，完整原始数据见支持信息。为消除谷类麸皮基质浸出的内源葡聚糖干扰，以添加相应载体的未接种空白培养基作为平行对照。
需注意，游离细胞与载体添加培养体系的细胞干重测定采用不同方案：（1）游离细胞发酵体系（FCFS）：称重并标记5 mL离心管为m₁，取1 mL发酵液与1 mL去离子水混合，6589 ×g离心10 min（HT165，湖南湘仪实验室仪器开发有限公司，中国长沙），弃上清，细胞沉淀用纯水冲洗两次；含细胞沉淀的离心管于65 °C干燥至恒重，记为m₂；细胞生物量按(m₂ − m₁)/v计算（v = 1 mL样品体积）。（2）惰性载体发酵体系（ICFS）：1 mL发酵样品先经100目砂芯漏斗分离以去除活性炭颗粒，漏斗中截留的载体用1 mL去离子水洗脱并超声处理5 min，洗脱与过滤重复三次以充分解吸载体附着的真菌细胞；三部分滤液合并转入预称重离心管，随后按与FCFS组相同的干燥与生物量计算程序处理。取20 mL发酵液于离心管中等体积（20 mL）蒸馏水稀释并充分混匀，稀释样品5000 ×g离心10 min，上清……（原文节选至此）
【数据】离心：6589 ×g、10 min（细胞干重测定）；干燥：65 °C至恒重；载体分离：100目砂芯漏斗；超声：5 min、重复3次；稀释离心：5000 ×g、10 min；样品体积：1 mL（生物量）、20 mL（稀释）
研究结果
3.1 惰性载体类型对β-葡聚糖产量的影响
#### 3.1.1 农业原料类型对β-葡聚糖产量的影响
如Castro等[20]所报道，本研究评估了一系列农业原料支持A. melanogenum合成β-葡聚糖的潜力，包括米糠、麦麸、麦秸、玉米芯、丝瓜络与甘蔗渣。所有载体材料以10 g/L的相同浓度加入。如图1a所示，这些农业原料的加入显著提高了β-葡聚糖产量——所有实验组产量均高于对照。其中，麦麸添加组获得最高β-葡聚糖效价（5.22 g/L）。尽管总糖产量未呈现统计学显著提升，麦麸组仍获得最高总糖产量（13.84 g/L）。
此外，筛选了三种麸皮（燕麦麸、麦麸与黑麦麸）作为固定化载体以确定最优麸皮基质。如图2a所示，三种麸皮载体均显著提高β-葡聚糖效价，产量均超过对照组。燕麦麸获得最高β-葡聚糖浓度，麦麸紧随其后，两组间无统计学显著差异（p > 0.05）。同时，图1a中甘蔗渣组的β-葡聚糖效价与麦麸组相当，表明多种农业副产物均可改善β-葡聚糖合成性能。相反，黑麦麸培养物获得最高总糖效价15.09 g/L。
为确认β-葡聚糖由A. melanogenum生物合成，设立未接种对照——即不含微生物接种（0%接种量）的麦麸基质培养基（图2b），以定量麦麸载体释放的内源多糖。未接种组浸出液中仅检出每升0.1 g葡聚糖；相比之下，接种组β-葡聚糖浓度达4.2 g/L。本研究此前工作证实，刚果红法可特异性结合A. melanogenum产生的β-葡聚糖，而与线性植物葡聚糖、普鲁兰与半纤维素几乎无交叉反应[30]。该结果有力表明，农业副产物载体几乎不释放可利用碳营养，其主要作为物理吸附支撑而非菌株生长与多糖合成的营养源。这一结果说明麦麸本身无法提供充足前体支持高β-葡聚糖产量；β-葡聚糖合成主要由载体诱导的菌株代谢通路调控驱动，麦麸的核心功能是促进菌株与反应底物之间的相互作用，从而提高β-葡聚糖产量。
如图2c所示，麦麸、燕麦麸与黑麦麸的吸水能力分别为1.59 g/g、2.17 g/g与0.77 g/g。燕麦麸吸水能力最高，也更易破碎。植物载体的严重破碎（如燕麦麸）会产生细碎屑，增加发酵液浊度，在工业运行中堵塞生物反应器管路与过滤器；破碎载体还导致细胞脱落，降低重复批次发酵中固定化细胞的稳定性。因此，粒径适中、破碎率低的载体更适合工业应用。综合实验结果，具有中等吸水能力的麦麸被选为后续研究的最优农业原料。
【数据】载体浓度：10 g/L；麦麸组β-葡聚糖：5.22 g/L；麦麸组总糖：13.84 g/L；燕麦麸与麦麸差异：p > 0.05；黑麦麸总糖：15.09 g/L；未接种组葡聚糖：0.1 g/L；接种组β-葡聚糖：4.2 g/L；吸水能力：麦麸1.59 g/g、燕麦麸2.17 g/g、黑麦麸0.77 g/g
#### 3.1.2 工业材料类型对β-葡聚糖产量的影响
本研究采用六种工业基质，包括10目活性炭、40目活性炭、25孔/英寸（ppi）聚氨酯泡沫、45 ppi聚氨酯泡沫、1.5 mm聚丙烯（PP）与2 mm聚丙烯（PP）。将A. melanogenum在这些工业载体添加体系中培养，考察并评价其对β-葡聚糖发酵的影响。所有载体材料以10 g/L的相同浓度加入。如图1b所示，工业基质的添加显著提升了A. melanogenum的β-葡聚糖产量效价。相对对照组，所有添加工业载体的实验组β-葡聚糖产量均有不同程度提高。其中，40目活性炭组表现最为突出，β-葡聚糖产量达6.24 g/L——显著高于其他载体组与对照组。相反，各组总糖产量未表现统计学显著改善，而1.5 mm PP组获得最高总糖产量（14.91 g/L）。因此，40目活性炭被选为后续研究的最优工业载体。
【数据】载体浓度：10 g/L；40目活性炭组β-葡聚糖：6.24 g/L；1.5 mm PP组总糖：14.91 g/L；工业载体类型：10目/40目活性炭、25/45 ppi聚氨酯泡沫、1.5/2 mm PP
#### 3.1.3 所选惰性载体添加量对β-葡聚糖产量的影响
##### 3.1.3.1 麦麸添加量的影响
麦麸添加量对β-葡聚糖发酵产量影响的实验数据见图3a。不同麦麸添加量对发酵过程中β-葡聚糖与总糖产量均有显著影响。当麦麸添加量为10 g/L时，β-葡聚糖产量达到峰值5.02 g/L——表明适量麦麸可显著提高β-葡聚糖产量。过量麦麸（>10 g/L）引入过多固体颗粒，加剧发酵液黏度，削弱传质与供氧，最终降低β-葡聚糖合成[31]。麦麸添加量进一步增加导致β-葡聚糖产量呈下降趋势。相反，总糖产量在麦麸添加量30 g/L时最高（13.76 g/L）。据此，10 g/L被确定为后续筛选实验的麦麸最优添加量。
【数据】麦麸最优添加量：10 g/L；β-葡聚糖峰值：5.02 g/L；总糖最高：13.76 g/L（30 g/L麦麸）；过量阈值：>10 g/L
##### 3.1.3.2 活性炭添加量的影响
活性炭添加量对β-葡聚糖发酵产量影响的实验数据见图3c。不同添加量的20目活性炭对发酵过程中β-葡聚糖与总糖产量均有显著影响。当20目活性炭添加量为20 g/L时，β-葡聚糖产量达到峰值6.69 g/L。低添加量时载体表面不足，限制细胞固定化；活性炭超过20 g/L时，过多固体颗粒扰乱流体混合、提高发酵液黏度，从而降低产物产量。活性炭添加量继续增加导致β-葡聚糖产量逐渐下降。相反，总糖产量在活性炭添加量30 g/L时最高（14.38 g/L）。据此，20 g/L的20目活性炭被确定为后续筛选实验的最优添加量。
【数据】活性炭：20目；最优添加量：20 g/L；β-葡聚糖峰值：6.69 g/L；总糖最高：14.38 g/L（30 g/L活性炭）；过量阈值：>20 g/L
#### 3.1.4 所选惰性载体目数对β-葡聚糖产量的影响
##### 3.1.4.1 麦麸目数对β-葡聚糖发酵产量的影响
麦麸目数对β-葡聚糖发酵产量影响的实验数据见图3b。不同目数麦麸样品（以10 g/L相同添加量加入）对发酵过程中β-葡聚糖与总糖产量均有显著影响。其中，40目麦麸添加组获得最高β-葡聚糖产量（5.47 g/L），表明40目麦麸促进β-葡聚糖产量的能力更突出。相反，β-葡聚糖产量呈下降趋势……（原文节选至此）
【数据】麦麸添加量：10 g/L；40目组β-葡聚糖：5.47 g/L；筛分范围：10–80目
3.2 载体微观形貌与细胞吸附状态（据图5、图6）
不同惰性载体的微观形貌经扫描电镜表征，用于定性评价表面质地与大孔结构。图5展示黑麦麸、燕麦麸、麦秸、丝瓜络、米糠、玉米芯、甘蔗渣、聚氨酯泡沫与聚丙烯（PP）的SEM图像。
图6为游离真菌与载体-真菌复合体的SEM照片：A为无载体的游离A. melanogenum细胞（FCFS对照）；B为未接种的原始麦麸；C为吸附固定化真菌细胞的麦麸表面；D为未使用的新鲜20目活性炭……（原文节选至此）
3.3 关键合成酶动态与重复批次发酵（据图4、图7）
图7给出游离细胞发酵体系（FCFS）与20目活性炭惰性载体体系（ICFS）中PGM（磷酸葡萄糖变位酶）、UGP（UDP-葡萄糖焦磷酸化酶）、GTF（葡糖基转移酶）、β-GS（β-葡聚糖合成酶）与UDPase（UDP酶）的动态变化。
图4比较了5 L发酵罐中游离细胞体系（a）与活性炭载体体系（b）的产量，并展示活性炭惰性载体体系在5 L发酵罐中的重复批次发酵（c），数据以mean ± SD表示，n = 2。
讨论与解读
本研究以惰性载体辅助发酵系统强化A. melanogenum的β-葡聚糖合成，核心结论可归为三点。其一，载体筛选与剂量、目数优化确定了20目活性炭为最优载体，ICFS较游离细胞体系提高β-葡聚糖产量40.19%。其二，农业来源载体主要充当物理固定化支撑而非碳营养源——未接种空白对照仅检出0.1 g/L葡聚糖，而接种组达4.2 g/L，刚果红法的特异性进一步排除了植物葡聚糖交叉干扰。其三，转录组与酶活分析表明载体通过调控糖酵解、半乳糖代谢等核心碳代谢通路并上调关键合成酶活性促进产物积累，重复批次发酵验证了系统运行稳定性；作者还将β-葡聚糖效价与产率同既往文献数据系统比较，以基准化工艺性能。
编译者解读：该研究的亮点在于用"惰性"二字做足了对照文章——未接种空白组把载体从营养源嫌疑中摘清，使产量提升可归因于物理微环境与代谢调控，而非廉价碳源补给。活性炭廉价易得、可原位灭菌、重复批次稳定，工程落地门槛低。局限亦明显：载体比表面积、孔径、孔隙率等物理参数未实测，仅凭SEM定性，导致"何种表面性质驱动强化"难以机理化；且放大仅至5 L罐、两平行，工业尺度下的传质与载体磨损仍是空白。
参考来源
期刊：Biochemical Engineering Journal, 2027
DOI: 10.1016/j.bej.2026.110469
DOI: 10.1016/j.bej.2026.110469