来源：细胞培养黑点污染支原体排查（DNA Lab Space 实验教程）| 编译：DNA Lab Space
镜下小黑点，换液后少一点，第二天又回来？细胞长得慢，培养液却不浑。别急着扔细胞，也别一口咬定是支原体。黑点可能是碎片、血清沉淀、细菌、真菌孢子；支原体反而常“隐身”。这篇按从快到慢的路径，先排低级错，再从试剂、操作、培养箱、传代到支原体专项检测逐项拆，给你能直接照做的动作链。
第一步：快速排查低级错误
枪头或移液器没灭菌——枪头盒开封后没高压，移液器杆没擦75%乙醇，直接换新枪头并拆杆擦拭。
超净台面不干净——台面只用紫外照30分钟不够，先用75%乙醇擦台面、挡板、移液器架，再紫外30分钟。
血清反复冻融——血清整瓶反复解冻会析出蛋白沉淀，分装10–15 mL/管，37°C水浴轻摇解冻，4°C保存不超过1个月。
换液太猛或细胞太稀——PBS沿壁加，1000 rpm离心5分钟去碎片，细胞密度低于30%时先浓缩传代。
第二步：分维度系统排查
1. 先看黑点会不会“动”
现象：100×镜下黑点满视野，400×下有的原地抖，有的直线跑。原理：布朗运动是碎屑；定向运动大概率是细菌。解决：取10 µL上清滴片，400×录10秒视频；同时取1 mL上清1000 rpm离心5分钟，看沉淀是否减少。验证：沉淀后黑点明显少，偏碎片；仍大量定向运动，按细菌污染处理，培养液加样做LB平板37°C过夜。
2. 查培养基和血清
现象：换新批血清后黑点增多，4°C放两天出现絮状物。原理：血清脂蛋白、钙磷盐低温析出，37°C可部分复溶；反复冻融会加重。解决：血清37°C水浴15分钟，轻摇混匀，不要涡旋；2000 g 4°C离心10分钟取上清去除大颗粒，但别常规反复离心。验证：同一细胞用旧血清和新血清各养24小时，400×计数5个视野黑点，新血清组下降50%以上就换批号。
3. 查超净台和培养箱
现象：同一培养箱不同细胞都出黑点，水盘有膜状物。原理：水盘、门封、CO2进气口是细菌和真菌储库。解决：水盘每周换无菌水，加0.1%硫酸铜? 不建议常规；直接高压水盘，75%乙醇擦内壁，紫外30分钟。验证：培养箱放空白培养基平皿开盖30分钟，37°C 5% CO2培养48小时，看菌落。
4. 查传代和冻存
现象：黑点随传代稀释，但冻存复苏后又出现。原理：冻存管口、DMSO、程序降温盒带菌；支原体可藏在细胞膜。解决：冻存液现配，DMSO用0.22 µm过滤；复苏后PBS 37°C洗2次，1000 rpm 5分钟。验证：复苏后第3天取上清做支原体PCR，同时DAPI染色看细胞外点状荧光。
5. 支原体专项检测
现象：细胞增殖慢、形态变圆、培养液清澈，黑点不一定多。原理：支原体0.1–0.3 µm，普通显微镜难见，0.22 µm滤膜不能可靠去除。解决：取1 mL上清，12000 g 4°C离心10分钟，弃上清留沉淀提DNA；16S rRNA通用引物PCR，95°C 5分钟，35循环（95°C 30秒、55°C 30秒、72°C 30秒）。验证：设无模板对照，阳性条带约270 bp；同时做Hoechst 33258 1 µg/mL 37°C染15分钟，荧光镜下细胞外点状荧光为阳性。污染严重直接丢弃；保留价值高的细胞用支原体清除剂1:1000处理2周，每3天PCR复检。
第三步：进阶疑难问题
黑点不消失但细胞状态好：大概率是血清沉淀或钙磷颗粒。37°C摇30分钟，400×看是否减少；不减少就换血清批号，别用0.1 µm过滤整瓶培养基，蛋白会丢。
PCR阳性但DAPI阴性：先排除气溶胶和引物二聚体。换新PCR管、做无模板对照、重复采样3次；仍阳性按支原体处理，别只看黑点。
清除后两周复发：查水盘、冻存管和移液器。水盘高压，冻存管口75%乙醇擦，清除期间每3天PCR，连续3次阴性再扩增。
避坑总结+实操建议
核心结论：黑点不等于支原体，先看运动性和沉淀结果；0.22 µm过滤不能当支原体去除；PCR必须带无模板对照，DAPI和PCR至少双验证。
日常好习惯：血清分装10–15 mL，解冻后4°C不超过1个月；培养箱水盘每周换无菌水，超净台先擦后紫外30分钟。
要自己设计支原体16S rRNA通用引物或qPCR引物，站内引物设计工具可直接跑；做支原体蛋白重组表达，密码子优化和蛋白可溶性优化也能顺手用。