来源：蛋白分泌表达少信号肽筛选（DNA Lab Space 实验教程）| 编译：DNA Lab Space
你换了三套信号肽，SignalP分数漂亮，上清Western还是空白；胞内条带却浓得发黑。别急着怪信号肽“没用”。分泌表达是条长链路，构建、转运、诱导、检测，任何一环掉链子都表现为“上清没货”。这篇按实验流程拆开，给你能直接照做的判断动作、具体参数和验证方法，专治信号肽筛选后分泌量低。
第一步：快速排查低级错误
先别做新克隆，查这4个坑。新手翻车大概率在这里。
- 质粒丢了或没转进去：诱导前不加抗生素，污染菌长得比表达菌还欢。解决：抽提质粒做酶切，重新转化，挑3-5个克隆保种。
- 阅读框错了：信号肽和成熟蛋白连接处多出1-2个碱基，翻译到一半停。解决：直接看测序峰图，把信号肽-目标蛋白 junction 翻译成氨基酸，确保信号肽酶切位点后紧接成熟N端。
- 忘了诱导或条件没到位：OD600没到0.6就加IPTG，或者IPTG终浓度只有0.01 mM。解决：37°C、200 rpm摇到OD600 0.6-0.8，加IPTG至0.1-1 mM，设未诱导对照。
- 检测上样太少：上清直接上样5 µL，SDS-PAGE根本看不见。解决：上清用3 kDa超滤管浓缩10倍，12%胶上样20 µL，Western一抗1:5000。
图1只帮你排掉明显坑。接着往流程里拆，别在错误构建上反复优化条件。
第二步：分维度系统排查
1. 信号肽预测高分，不等于真分泌。
现象：SignalP 6.0给0.95，上清ELISA却接近背景，胞内Western很浓。原理：预测看N端疏水核心和切割位点，宿主密码子、mRNA二级结构、信号肽酶识别都会拖后腿。解决：做15-30 aa信号肽小库，保留7-15 aa疏水核心，-1位优先Ala/Ser，+1位避开Pro/Gly；信号肽后