来源：An electroactive RNA-cleaving DNAzyme based electrochemical biosensor for enzyme-free detection of microRNA（Bioelectrochemistry）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
microRNA-21是多种癌症中失调的致癌生物标志物，但其在复杂生物样本中的低丰度检测仍依赖酶扩增或标记步骤。本研究将Mg²⁺依赖的8–17 DNAzyme改造为可直接识别miR-21的电活性RNA切割DNAzyme（e-RCD），通过靶标激活催化切割、释放亚甲蓝标记片段产生浓度依赖的电化学信号。传感器在500 aM至50 nM范围内线性响应，检出限低至107 aM，并在血清样本中获得满意回收率。
研究背景
癌症仍是全球主要死因之一，其早期诊断与准确预后对治疗干预和患者生存率提升至关重要。生物标志物在此扮演可靠而灵敏的角色。已探索的癌症标志物包括蛋白质、循环肿瘤DNA、microRNA和代谢物等。其中，miRNA作为一类小型非编码RNA，因在基因表达调控和肿瘤发生中的关键作用而成为有前景的癌症标志物。它们存在于血液、唾液和尿液等多种液体活检样本中，适合无创检测。相比其他标志物，miRNA因抗核酸酶降解而高度稳定。其失调表达模式是肿瘤发生的关键指标，可作为癌基因或抑癌基因，为癌症类型和分期提供信息。与多种癌症相关的miRNA谱系广泛，其中miR-21在多种癌症中失调，是临床意义显著的致癌标志物，亟需快速、灵敏且经济的检测策略。
研究方法
2 实验部分
本研究所用全部化学品、缓冲液和寡核苷酸（表S1）列于补充信息中。
2.1 聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）研究
采用聚丙烯酰胺凝胶电泳验证工程化RCD探针在传感缓冲液（SB）中、无Mg²⁺与有Mg²⁺辅因子条件下由miR-21诱导的催化切割活性。泳道1：25 bp DNA Ladder；泳道2：RCD（2 μM）；泳道3：miR-21（1 μM）；泳道4：RCD（2 μM）与miR-21（1 μM）；泳道5：RCD（2 μM）、miR-21（1 μM）与Mg²⁺（30 mM）。所有最终反应混合物与SB在室温下孵育90分钟。
【数据】探针浓度：RCD 2 μM；靶标浓度：miR-21 1 μM；Mg²⁺浓度：30 mM；孵育温度：室温（RT）；孵育时间：90 min；缓冲液：传感缓冲液（SB）； ladder：25 bp DNA Ladder
2.2 生物传感器构建
miR-21特异性电化学生物传感器构建于三电极系统上，该系统包含丝网印刷金电极（SPGE），配有金工作电极、金对电极和Ag/AgCl参比电极。修饰前，电极表面先用乙醇和去离子水冲洗清洁，再在氮气流下干燥。随后，施加100 W氧气等离子体处理1分钟以获得亲水表面。接着，在0.5 M H₂SO₄中于0至1.5 V电位范围内进行循环伏安（CV）扫描直至获得稳定伏安图，以电化学清洁电极表面。之后，在30 mM HAuCl₄的0.5 M H₂SO₄溶液中，以−0.3 V恒电位计时电流法电沉积金纳米结构（AuNS）于SPGE表面300秒。随后，AuNS/SPGE电极用去离子水冲洗并在室温（RT）下干燥。传感表面通过将硫醇化亚甲蓝修饰的RNA切割DNAzyme探针固定于AuNS/SPGE电极上制备。固定e-RCD探针前，在固定缓冲液（IB）中配制2 μM探针溶液，与500 μM TCEP在室温避光条件下孵育90分钟以还原二硫键。随后，取5 μL还原探针溶液滴铸于新鲜制备的AuNS/SPGE表面，在4 °C湿润条件下孵育过夜。所有未结合探针用洗涤缓冲液（WB）小心冲洗，并以氮气流干燥。接着，传感表面与1 mM MCH溶液在避光下孵育20分钟以防止非特异性吸附。最后，电极用WB冲洗，N₂气干燥，并于4 °C湿润环境中保存以备后续研究。
【数据】等离子体处理：100 W，1 min；CV扫描范围：0至1.5 V；H₂SO₄浓度：0.5 M；电沉积电位：−0.3 V；电沉积时间：300 s；HAuCl₄浓度：30 mM；探针浓度：2 μM；TCEP浓度：500 μM；TCEP孵育：90 min，RT，避光；探针滴铸体积：5 μL；探针固定：4 °C，过夜，湿润；MCH浓度：1 mM；MCH孵育：20 min，避光；保存条件：4 °C，湿润
2.3 生物传感器性能评估
所有电化学实验均使用CHI-660E电化学分析仪（CH Instruments，美国）进行。采用方波伏安法（SWV）评估所构建生物传感器的分析性能，在传感缓冲液中考察500 aM至50 nM合成miR-21浓度范围内的剂量-响应关系。SWV参数：电位范围0.1至−0.5 V，频率15 Hz，振幅25 mV，步进电位5 mV。在相同优化实验条件下，使用结构相似的干扰miRNA（包括miR-141、let-7d、miR-200b和miR-429）评估生物传感器选择性。此外，采用已知浓度miR-21（1、10、100和1000 pM）加标至稀释血清样本中进行靶标回收实验。
【数据】仪器：CHI-660E电化学分析仪；检测浓度范围：500 aM至50 nM；电位范围：0.1至−0.5 V；频率：15 Hz；振幅：25 mV；步进电位：5 mV；干扰miRNA：miR-141、let-7d、miR-200b、miR-429；回收实验浓度：1、10、100、1000 pM；样本基质：稀释血清
研究结果
3 结果与讨论
3.1 miR-21特异性e-RCD探针的设计
为开发高灵敏检测miR-21的电化学生物传感器，将文献充分记载的Mg²⁺依赖8–17 DNAzyme改造为miR-21特异性电活性RNA切割DNAzyme（e-RCD）。标准8–17 DNAzyme由催化核心、两个底物结合臂和一条含切割位点的互补链组成（图3A）。尽管其具有优异催化切割活性，但缺乏直接识别miR-21的能力，因为其底物结合臂仅设计用于结合互补切割底物而非miR-21。为高灵敏检测miR-21，通过引入T环区域、核糖腺苷（rA）切割位点和延长的底物结合臂对DNAzyme结构进行重新设计（图3B）。T环的加入提供结构柔性并促进催化核心的正确排列，延长的底物结合臂则增强对miR-21的亲和力。此外，Mg²⁺依赖8–17 DNAzyme的催化核心保持不变以维持其催化切割功能。与标准DNAzyme中切割位点、催化核心和底物结合臂分处两条不同链不同，重新设计的RNA切割DNAzyme（RCD）将上述元件全部置于单链内，实现靶标特异性激活。当miR-21在Mg²⁺离子存在下与互补底物结合臂杂交时，发生链切割，释放切割片段。该切割机制高度依赖miR-21靶标杂交与Mg²⁺离子两者。靶标杂交稳定RCD结构并促进催化核心激活，Mg²⁺离子则作为磷酸二酯键切割所需的重要辅因子。为构建基于RCD的miR-21检测电化学生物传感器，RCD探针一端修饰亚甲蓝（MB）——一种产生电化学信号的电活性氧化还原探针，另一端修饰硫醇基团以固定于丝网印刷金电极（SPGE）上。
【数据】DNAzyme架构：Mg²⁺依赖8–17 DNAzyme；新增元件：T环、rA切割位点、延长底物结合臂；探针修饰：一端亚甲蓝（MB），一端硫醇基团；电极：丝网印刷金电极（SPGE）；原文未详述其他数值
3.2 PAGE验证RCD切割
构建生物传感器前，进行聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）分析以验证工程化RCD探针由miR-21诱导的催化切割活性（图1A）。该分析旨在确认仅在miR-21与Mg²⁺同时存在时才有切割活性。结果显示，泳道1（含25 bp DNA Step Ladder）和泳道2（仅含RCD探针）显示单一清晰条带，对应完整探针。同样，泳道3（仅含miR-21）显示对应合成miR-21的条带。当RCD探针与miR-21在无Mg²⁺条件下孵育（泳道4）时，结果显示对应完整RCD探针和miR-21的条带，无额外切割片段。这证实仅miR-21杂交不足以在缺乏所需金属离子辅因子（Mg²⁺）时启动催化切割反应。相反，当反应混合物中加入Mg²⁺（泳道5）时，出现一条对应切割片段的额外低分子量条带，同时可见其他切割及完整RCD探针与miR-21的条带。切割片段的出现证实工程化RCD探针在Mg²⁺存在下识别miR-21后成功激活催化切割机制。这些PAGE结果与所提出的传感机制完全吻合，并提供实验确认，有助于提高电化学传感的分析灵敏度。
【数据】泳道1：25 bp DNA Ladder；泳道2：RCD 2 μM；泳道3：miR-21 1 μM；泳道4：RCD 2 μM + miR-21 1 μM（无Mg²⁺）；泳道5：RCD 2 μM + miR-21 1 μM + Mg²⁺ 30 mM；孵育：SB，RT，90 min；切割片段：泳道5出现低分子量条带
3.3 电化学生物传感器的构建
确认RCD的miR-21特异性切割活性后，在SPGE上构建电化学生物传感器。固定e-RCD探针前，电极表面电沉积AuNS。该层显著增加电活性表面积，同时为硫醇化e-RCD探针的固定提供丰富的Au–S结合位点。此类AuNS生物传感层已被广泛报道可提高探针固定密度并增强电子传递效率，从而改善生物传感器灵敏度。硫醇化MB标记的e-RCD探针通过强Au–S共价相互作用固定于AuNS/SPGE表面。引入MB作为电活性氧化还原报告分子，使得无需外部氧化还原介质或额外酶扩增即可通过SWV直接电化学监测探针切割。电化学传感机制依赖于miR-21和Mg²⁺离子触发固定化e-RCD探针的催化切割（图3C）。无miR-21时，探针保持完整，MB报告分子靠近电极表面，无切割发生，产生高基线电化学响应。然而，在Mg²⁺离子存在下引入miR-21后，探针发生结构重排，促进与靶标杂交并激活e-RCD催化核心，导致位点特异性探针切割循环。该切割将探针的MB标记片段部分从电极表面释放，导致电化学响应显著下降。
【数据】电沉积层：金纳米结构（AuNS）；固定方式：Au–S共价键；报告分子：亚甲蓝（MB）；检测技术：SWV；信号变化：无靶标时高基线响应，靶标存在时响应显著下降；原文未详述其他数值
3.4 生物传感条件的优化
为实现该传感平台的最大分析性能，对固定化e-RCD探针浓度和Mg²⁺辅因子浓度进行优化。由于miR-21检测依赖电极表面e-RCD探针与Mg²⁺离子两者的可用性以激活催化切割机制，优化这些参数对实现高检测灵敏度同时维持低背景信号十分重要。首先，为确定最佳e-RCD探针浓度，将不同浓度探针（0.1–3.0 μM）固定于生物传感表面。如图1B所示，MB氧化电流随探针浓度增加至2.0 μM而上升；超过该浓度后仅观察到边际改善，表明传感表面已达饱和。因此，选择2.0 μM e-RCD浓度用于所有后续传感实验。此外，在2.0 μM e-RCD探针和50 nM miR-21实验条件下，评估传感缓冲液中0–50 mM范围内Mg²⁺离子浓度的影响。结果（图1C）显示，MB信号随Mg²⁺浓度增加而逐渐下降。在低于30 mM浓度时，由于传感表面上Mg²⁺离子浓度过高，信号达到饱和。因此，选择30 mM Mg²⁺作为传感缓冲液中的最佳浓度用于后续电化学测量。
【数据】探针浓度范围：0.1–3.0 μM；最佳探针浓度：2.0 μM；Mg²⁺浓度范围：0–50 mM；最佳Mg²⁺浓度：30 mM；miR-21浓度：50 nM；信号趋势：MB氧化电流随探针浓度升至2.0 μM后趋饱和；MB信号随Mg²⁺浓度升高而下降，低于30 mM时饱和
3.5 生物传感器的分析性能
优化e-RCD探针和Mg²⁺浓度后，采用SWV在500 aM至50 nM临床相关浓度范围内以合成miR-21评估生物传感器分析性能。SWV结果（图2A）显示对应MB氧化还原的明确氧化峰。引入递增浓度miR-21后，MB氧化电流逐渐下降。该电流下降源于生物传感表面上固定化e-RCD探针催化切割的增加。正常情况下，氧化还原分子非常接近传感表面，产生较高峰电流。然而，切割发生后，氧化还原分子与传感表面的接近程度降低，导致空间位阻和电子传递减少，产生较低峰电流。图2B显示miR-21检测的相应校准曲线，表明SWV峰电流（I）与miR-21浓度的对数值之间呈强线性关系。
【数据】检测范围：500 aM至50 nM；信号：MB氧化峰电流随miR-21浓度递增而下降；线性关系：SWV峰电流（I）与miR-21浓度对数值呈强线性；检出限：107 aM（见结论）；原文未详述校准曲线具体斜率与R²数值
讨论与解读
本研究开发了一种基于电活性RNA切割DNAzyme（e-RCD）的电化学生物传感器，用于miR-21免酶检测。Mg²⁺依赖8–17 DNAzyme经改造后可直接识别miR-21并保留催化活性。所构建传感器通过释放e-RCD探针上亚甲蓝标记片段，将靶标诱导的催化切割机制转化为可测量的电化学信号。优化条件下，传感器线性检测范围为500 aM至50 nM，检出限低至107 aM。传感器对结构相近miRNA表现出良好选择性，在加标血清样本中获得满意回收率，凸显该平台用于复杂临床样本的潜力。通过重新设计靶标识别臂并保留催化核心，该传感机制可拓展至其他临床相关miRNA和核酸标志物。因此，该平台在即时检测（POC）与液体活检的多重检测应用方面具有可观潜力，有助于下一代早期诊断与精准医学生物传感器的发展。
编译者解读：该工作把DNAzyme的靶标识别臂"移植"到单链e-RCD上，用切割-释放MB片段替代酶扩增，思路简洁、成本低，107 aM的检出限在免酶电化学传感中颇具竞争力。局限在于：单靶标验证、血清仅为加标回收，未展示真实临床样本中的基质干扰与批间重复性；单链探针的稳定性与电极再生能力也待考察。若要走向POC，多重化与微流控集成是下一步关键。
参考来源
期刊：Bioelectrochemistry, 2027
DOI: 10.1016/j.bioelechem.2026.109483
DOI: 10.1016/j.bioelechem.2026.109483