来源：质粒共转染荧光淬灭内参校正（DNA Lab Space 实验教程）| 编译：DNA Lab Space
共转染做完，孔里不是没荧光，就是内参忽高忽低，校正后数据更乱。别急着怪显微镜。质粒质量、共转染比例、细胞状态、固定通透和通道串色，每一环都能把校正曲线带偏。下面按“快速排错—系统定位—进阶疑难”拆开讲，给你能直接照做的参数、判断动作和验证方法。
第一步：快速排查低级错误
先别洗板。三分钟看这几项。
1. 质粒浓度和纯度不对：A260/280低于1.75或A260/230低于2.0，盐和蛋白残留会让共转染效率跳变；重提一次，用1%琼脂糖胶看是否降解。
2. 转染比例拍脑袋：24孔板总质粒0.5 μg，目标质粒100-200 ng、内参100 ng，脂质体1.5 μL；先做1:1、1:2、1:3三组，别把内参照质粒加得比目标还多。
3. 细胞密度偏了：转染时70%-80%汇合，24孔板每孔1.5×10^5个细胞；过密15 h就挤，过稀24 h还贴不匀。
4. 曝光把内参打饱和：先看单通道最大像素，控制在动态范围