来源：Inhibitory effects of the herbal quorum sensing quencher isoorientin on spoilage characteristics of Serratia liquefaciens S01: In vitro and in a smoked chicken leg model（International Journal of Food Microbiology）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
熏鸡腿在加工贮运中易受液化沙雷氏菌污染而腐败。本研究以该菌的群体感应核心蛋白LuxI与LuxR为靶点，从11000个中药小分子中虚拟筛选出10个潜在淬灭剂，最终锁定异荭草素——其MIC为250 μg/mL，亚抑菌浓度下显著抑制胞外多糖、生物膜与C4-HSL分泌；4 °C贮藏试验中125 μg/mL处理组菌落总数仅5.45 log CFU/g、TBARS值1.15 mg/kg，并延缓感官劣变。这为天然群体感应淬灭型防腐剂提供了候选分子与体内外证据链。
研究背景
熏鸡腿是中式传统熏烤肉制品，因酱卤与糖熏风味而广受欢迎。但加工、贮藏、运输环节易被腐败菌侵染，导致品质劣变、货架期缩短，既造成经济损失也带来食品安全隐患。群体感应（QS）是细菌通过分泌与感知信号分子调控群体行为的细胞间通讯机制，被视为食品腐败的关键驱动因素。多数食品腐败菌为革兰氏阴性菌，其QS系统主要由N-酰基高丝氨酸内酯（AHLs）调控，其中LuxI与LuxR是最典型的两个核心组分：LuxI是催化AHLs合成与分泌的信号合成酶，LuxR是结合AHLs形成活性复合物、进而调控生物膜形成与胞外酶分泌等下游基因表达的信号受体。因此靶向细菌QS已成为控制腐败的有前景的抗菌策略。本研究即以此为切入点，筛选靶向液化沙雷氏菌S01 LuxI/LuxR的中药来源QS淬灭剂，并在体外与熏鸡腿模型中评价其抑腐效果。
研究方法
2.1 菌株与化学试剂
本研究所用液化沙雷氏菌S01分离自本课题组前期研究中的熏鸡腿样品（Wang et al., 2024）。紫色色杆菌CV026与根癌农杆菌KYC55购自上海生物工程股份有限公司。全部菌株以−80 °C保存于东北农业大学肉品科学实验室。群体感应信号分子N-丁酰基-L-高丝氨酸内酯（C4-HSL）、N-己酰基-L-高丝氨酸内酯（C6-HSL）、N-辛酰基-L-高丝氨酸内酯（C8-HSL）、N-癸酰基-L-高丝氨酸内酯（C10-HSL）、N-十二酰基-L-高丝氨酸内酯（C12-HSL）和N-十四酰基-L-高丝氨酸内酯（C14-HSL）购自上海ZZbio有限公司（中国上海）。中药小分子化合物异荭草素、靛玉红、靛蓝、异牡荆素、白术内酯III、α-红没药烯、木香烃内酯、红没药醇、愈创蓝油烃、δ-杜松烯、去氢木香内酯和甘草酚均购自南京源植生物科技有限公司（中国南京）。Lennox Bertani（LB）肉汤与LB琼脂购自北京博奥拓达科技有限公司（中国北京）。
【数据】菌株：液化沙雷氏菌S01、紫色色杆菌CV026、根癌农杆菌KYC55；保存温度：−80 °C；AHL标准品：C4-HSL、C6-HSL、C8-HSL、C10-HSL、C12-HSL、C14-HSL；培养基：LB肉汤、LB琼脂；试剂来源：上海ZZbio、南京源植生物、北京博奥拓达
2.2 液化沙雷氏菌S01 AHLs的检测
#### 2.2.1 定性分析
参照Zhang等（2025）的方法，采用生物传感器法对AHLs进行定性检测。AHLs主要由保守的高丝氨酸内酯环和可变的酰基侧链组成。按酰基侧链碳链长度，AHLs可分为短链（C4–C8）与长链（C10–C18）两类。不同链长的AHLs可被报告菌株特异识别，产生特征性显色反应。紫色色杆菌CV026常用于检测短链AHLs，根癌农杆菌KYC55则用于检测短链与长链AHLs。两种报告菌联用可覆盖全部链长AHLs的检测。将液化沙雷氏菌S01与两株报告菌分别培养至OD600为1.0。对于根癌农杆菌KYC55，LB琼脂倾注平板凝固后，取20 μL 5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-半乳糖苷（X-Gal，20 mg/mL）均匀涂布于琼脂表面并风干。随后以T型划线法接种液化沙雷氏菌S01与根癌农杆菌KYC55。对于紫色色杆菌CV026，将10%的菌液与55 °C的LB琼脂充分混匀后倾注平板。琼脂凝固后用牛津杯打孔，向孔中加入150 μL液化沙雷氏菌S01培养液。30 °C培养24 h后记录平板显色情况。本实验中以报告菌自身培养物为阴性对照，C8-HSL与C4-HSL分别作为根癌农杆菌KYC55与紫色色杆菌CV026的阳性对照。
【数据】菌株：S01、CV026、KYC55；OD600：1.0；X-Gal：20 mg/mL，20 μL；CV026菌液比例：10%；LB琼脂温度：55 °C；加样量：150 μL；培养条件：30 °C、24 h；阳性对照：C8-HSL（KYC55）、C4-HSL（CV026）
#### 2.2.2 定量分析
参照Hou等（2017）的方法并略作修改提取液化沙雷氏菌S01的AHLs。简述如下：取50 mL液化沙雷氏菌S01培养液，4 °C、12,000 ×g离心15 min。收集上清液，用等体积含0.1%冰醋酸的乙酸乙酯萃取两次。每次萃取后弃去水层、保留有机层。合并的乙酸乙酯萃取液用旋转蒸发仪在真空（0.02 MPa）、35 °C条件下浓缩以蒸干溶剂。残留物用1 mL乙腈复溶，经无菌0.22 μm滤膜过滤。参照Darja等（2016）的方法，采用AB5500 QTrap三重四极杆质谱仪（AB Sciex Pte. Ltd.，新加坡）对提取的AHLs进行鉴定与定量。分离在Acquity UPLC® BEH C18色谱柱（2.1 mm × 50 mm，粒径1.7 μm）上进行。流动相为（A）含0.1%甲酸的水与（B）含0.1%甲酸的乙腈。质谱检测采用电喷雾电离（ESI）源正离子模式。质量扫描范围100–1200 m/z。
【数据】培养液体积：50 mL；离心：12,000 ×g、15 min、4 °C；萃取剂：等体积含0.1%冰醋酸乙酸乙酯，萃取2次；浓缩：0.02 MPa、35 °C；复溶：1 mL乙腈；滤膜：0.22 μm；色谱柱：BEH C18（2.1 mm × 50 mm，1.7 μm）；流动相：0.1%甲酸水/0.1%甲酸乙腈；离子源：ESI正离子；扫描范围：100–1200 m/z
2.3 液化沙雷氏菌S01 QS蛋白与中药小分子化合物的选择与制备
根据Ding等（2018）的研究，液化沙雷氏菌的QS系统属于LuxI/LuxR系统。预实验中通过凝胶电泳确认液化沙雷氏菌S01的QS蛋白对应LuxI与LuxR同源物（图S1）。因此以LuxI与LuxR蛋白为受体，通过分子对接筛选靶向液化沙雷氏菌S01的中药QS淬灭剂。LuxI（UniProt ID：P52989）与LuxR（UniProt ID：A0A379Y5B3）蛋白模型均从UniProt数据库（https://www.uniprot.org/）下载。采用AutoDockTools-1.5.6软件（The Scripps Research Institute，美国拉霍亚）对蛋白结构进行预处理：去除水分子、加氢原子、能量最小化并定义活性位点。配体分子从TCMSP数据库（https://www.tcmsp-e.com/load_intro.php）获取。配体分子同样用AutoDockTools-1.5.6软件预处理：加氢原子、能量最小化并检查可旋转键。
【数据】蛋白：LuxI（P52989）、LuxR（A0A379Y5B3）；软件：AutoDockTools-1.5.6；数据库：UniProt、TCMSP；预处理：去水、加氢、能量最小化、定义活性位点、检查可旋转键
2.4 分子对接
将预处理后的中药小分子化合物分别与LuxI和LuxR蛋白用AutoDockTools-1.5.6进行对接。对于LuxI，网格盒中心设于结合口袋（X = 9.080，Y = −2.399，Z = 1.988），覆盖Asp67、Ile102、Ser121等关键残基。对于LuxR，网格盒中心设于结合口袋（X = −7.389，Y = −1.044，Z = 2.940），覆盖Tyr86、Arg102、Ser167等关键残基。两种蛋白的网格尺寸均设为30 × 30 × 30 Å以充分覆盖结合腔。网格设置完成后执行对接，初步选取评分结果前2%的中药小分子化合物。随后用Discovery Studio 2021（BIOVIA，美国圣迭戈）客户端软件的LibDock模块在High Quality模式下进一步筛选，排名前1%的分子采用"-CDOCKER"协议对接。依据结合能、对接构象稳定性与相互作用力强度挑选排名最高的小分子进行后续验证。蛋白-配体复合物用PyMOL软件（Schrödinger, LLC，美国纽约）可视化，蛋白-配体结合的三维（2D）相互作用分析用DS软件完成。
【数据】LuxI网格中心：X = 9.080、Y = −2.399、Z = 1.988；LuxR网格中心：X = −7.389、Y = −1.044、Z = 2.940；网格尺寸：30 × 30 × 30 Å；初筛：前2%；复筛：前1%（LibDock High Quality）；精对接：-CDOCKER；可视化：PyMOL、Discovery Studio 2021
2.5 QS淬灭剂MIC的测定
筛选所得10种中药小分子化合物对液化沙雷氏菌S01的MIC值测定方法原文节选至此中断，后续步骤原文未详述。
【数据】化合物数量：10种；测定对象：液化沙雷氏菌S01；MIC具体操作：原文未详述
研究结果
3.1 液化沙雷氏菌S01所产AHLs的鉴定
液化沙雷氏菌S01的AHL活性验证如图1A所示。阴性对照无显色，阳性对照呈蓝色。液化沙雷氏菌S01在含X-Gal条件下与根癌农杆菌KYC55产生蓝色反应，证实其具备产AHLs的能力。液化沙雷氏菌S01的短链AHL活性验证如图1B所示。阴性对照无颜色变化，阳性对照形成紫色晕圈。液化沙雷氏菌S01诱导紫色色杆菌CV026产生紫色杆菌素，表明该菌能产短链AHLs。
随后进行定性与定量分析以表征液化沙雷氏菌S01所产AHLs。六种混合AHL标准品的色谱图如图2A所示，包括C4-HSL（1.76 min）、C6-HSL（2.64 min）、C8-HSL（3.73 min）、C10-HSL（4.78 min）、C12-HSL（5.76 min）和C14-HSL（6.71 min）。依据保留时间及前体离子与产物离子的相对丰度，发现液化沙雷氏菌S01主要分泌两种AHLs，即C4-HSL与C6-HSL（图2B）。其中C4-HSL丰度最高，定量浓度为530.08 ng/mL。这一短链AHLs分泌谱与Sara等（2015）关于沙雷氏菌属的既往报道一致。
【数据】阳性对照：KYC55呈蓝色、CV026呈紫色晕圈；标准品保留时间：C4-HSL 1.76 min、C6-HSL 2.64 min、C8-HSL 3.73 min、C10-HSL 4.78 min、C12-HSL 5.76 min、C14-HSL 6.71 min；S01主要AHLs：C4-HSL、C6-HSL；C4-HSL浓度：530.08 ng/mL
3.2 筛选所得QS淬灭剂的对接评分与MIC值
中药小分子化合物与LuxI、LuxR蛋白的结合模式如图3所示。将LuxI与LuxR蛋白与11,000个中药小分子化合物进行分子对接，获得10个结合亲和力良好的化合物。这10个中药小分子化合物依据结合能均可结合于LuxI与LuxR蛋白的活性口袋，但各化合物对两种蛋白的结合亲和力存在明显差异。
在与LuxI蛋白的对接结果中，异荭草素、靛玉红、靛蓝与异牡荆素表现出较优的结合潜力，CDOCKER_ENERGY评分分别为−45.4163 kcal/mol、−45.25 kcal/mol、−45.16 kcal/mol和−44.59 kcal/mol。在与LuxR蛋白的对接结果中，白术内酯III、α-红没药烯、木香烃内酯、红没药醇、愈创蓝油烃与δ-杜松烯表现出较强的结合潜力，CDOCKER_ENERGY评分分别为−65.23 kcal/mol、−64.78 kcal/mol、−59.07 kcal/mol、−46.90 kcal/mol、−46.85 kcal/mol和−46.23 kcal/mol。这些结果表明10个中药小分子化合物各自与其对应靶蛋白均具有良好结合亲和力。
10个小分子化合物与LuxI、LuxR蛋白对接口袋附近氨基酸残基的二维相互作用如图4所示。对于LuxI蛋白，异荭草素与Tyr86（1.86 Å）、Arg102（3.06 Å）、Ala100（1.88 Å）和Leu103（2.57 Å）形成稳定氢键。靛玉红与Tyr86形成氢键（2.44 Å和2.74 Å）。靛蓝与Leu35（2.62 Å）、Glu168（2.54 Å、2.03 Å）和Tyr86（2.66 Å）形成氢键。异牡荆素与Tyr58（2.37 Å）、Trp54（2.56 Å）、Asp67（2.48 Å）、Ser97（1.80 Å）、Ile102（2.58 Å）和Ser121（1.85 Å）形成氢键。这些化合物与LuxI蛋白的多个保守氨基酸残基相互作用，为其作为竞争性淬灭剂的潜在作用提供理论支持。
对于LuxR蛋白，白术内酯III与Asp67形成氢键（2.62 Å）。木香烃内酯与Trp54形成氢键（2.54 Å）。红没药醇与Ser121形成氢键（1.82 Å）。而α-红没药烯、愈创蓝油烃与δ-杜松烯主要通过与LuxR蛋白结合口袋的疏水作用与范德华力相互作用，未形成常规氢键。这种结合模式使其能有效竞争性占据AHLs识别位点，从而为其QS淬灭活性提供结构基础。
【数据】对接化合物总数：11,000个；入选化合物：10个；LuxI对接评分：异荭草素−45.4163 kcal/mol、靛玉红−45.25 kcal/mol、靛蓝−45.16 kcal/mol、异牡荆素−44.59 kcal/mol；LuxR对接评分：白术内酯III −65.23 kcal/mol、α-红没药烯−64.78 kcal/mol、木香烃内酯−59.07 kcal/mol、红没药醇−46.90 kcal/mol、愈创蓝油烃−46.85 kcal/mol、δ-杜松烯−46.23 kcal/mol；氢键距离：异荭草素-Tyr86 1.86 Å、Arg102 3.06 Å、Ala100 1.88 Å、Leu103 2.57 Å；白术内酯III-Asp67 2.62 Å；木香烃内酯-Trp54 2.54 Å；红没药醇-Ser121 1.82 Å
3.3 候选QS淬灭剂淬灭活性的验证
10种中药小分子化合物对液化沙雷氏菌S01的MIC值见表1，其在亚抑菌浓度（1/2 MIC）下的群体淬灭活性如图5所示。10种中药小分子化合物的群体淬灭活性依据LB琼脂平板上形成的紫色晕圈直径评估。与对照相比，所有处理均使晕圈直径减小，表明10种化合物均发挥不同程度的QS淬灭作用。其中，异荭草素、白术内酯III、红没药醇与δ-杜松烯处理的平板晕圈较小，表明这4种化合物的群体淬灭活性较强。
【数据】测试浓度：1/2 MIC；评价指标：紫色晕圈直径；活性较强化合物：异荭草素、白术内酯III、红没药醇、δ-杜松烯；各化合物MIC具体数值：原文未详述（见表1）
3.4 Ro5评价
为评价10种中药小分子化合物作为熏鸡腿防腐剂的理化适用性，10种化合物的Ro5性质见表2。所有化合物分子量均低于500 Da，其中愈创蓝油烃分子量最低（198.3 Da），异荭草素分子量最高（448.3 Da）。所有化合物均表现出理想的log P值，表明其在水溶性与膜通透性之间具有平衡潜力（Majumdar and Mandal, 2025）。
【数据】分子量范围：<500 Da；最低分子量：愈创蓝油烃198.3 Da；最高分子量：异荭草素448.3 Da；log P：均理想；具体log P数值：原文未详述（见表2）
3.5 ADMET性质预测
为评价10种中药小分子化合物作为熏鸡腿防腐剂的潜在安全性与生物利用度，10种化合物的ADMET性质见表3。吸收方面，白术内酯III水溶性最差（−4.92 log mol/L），异荭草素与异牡荆素溶解性相对较好（−2.7 log mol/L）。靛玉红与靛蓝的Caco-2通透性极低（−5.96 × 10−6 cm/s），而α-红没药烯等萜类则显示较高通透性。异荭草素、靛玉红、靛蓝与异牡荆素被鉴定为P-糖蛋白底物，易被外排。分布方面，异荭草素表观分布容积最大，表明其更倾向于向组织分布。代谢方面，靛玉红与靛蓝为CYP3A4底物，并抑制CYP1A2与CYP2C19。其余化合物与CYP酶相互作用较弱，提示药物相互作用风险低。排泄方面，α-红没药烯总清除率最高，异荭草素清除最慢。异荭草素还具有极长的半衰期（196.60 h），表明其体内消除缓慢，而木香烃内酯消除最快。毒性方面，靛玉红与靛蓝呈现不可接受的风险，二者均被预测具有致癌性、肝毒性及潜在心脏毒性，因此被排除于后续研究之外。其余8种化合物毒性检测均为阴性。综合10种中药小分子化合物的QS淬灭活性、潜在生物利用度、食品适用性与安全性，异荭草素、白术内酯III、红没药醇与δ-杜松烯更具实际应用潜力。
【数据】水溶性：白术内酯III −4.92 log mol/L、异荭草素与异牡荆素−2.7 log mol/L；Caco-2通透性：靛玉红/靛蓝−5.96 × 10−6 cm/s；P-gp底物：异荭草素、靛玉红、靛蓝、异牡荆素；半衰期：异荭草素196.60 h；毒性阳性：靛玉红、靛蓝（致癌、肝毒、潜在心脏毒性）；毒性阴性：其余8种；优选化合物：异荭草素、白术内酯III、红没药醇、δ-杜松烯
3.6 分子动力学模拟
为评价所得复合物在动态条件下的稳定性，对淬灭作用较强的4种化合物（异荭草素、白术内酯III、红没药醇、δ-杜松烯）与其各自靶蛋白的结合复合物进行了100 ns分子动力学模拟（MDS）。4种复合物的RMSD结果如图6A与6B所示。4个体系在100 ns模拟后期均达到结构平衡。其中LuxI-异荭草素复合物稳定性最高，其蛋白骨架RMSD值稳定在……原文节选至此中断，后续数值原文未详述。
【数据】模拟时长：100 ns；模拟复合物：LuxI-异荭草素、LuxR-白术内酯III、LuxR-红没药醇、LuxR-δ-杜松烯；最稳定复合物：LuxI-异荭草素；RMSD具体数值：原文未详述
讨论与解读
研究确认C4-HSL为液化沙雷氏菌S01分泌的主要QS信号分子。以LuxI与LuxR为靶点从TCMSP数据库对接筛选出10个小分子化合物，其中异荭草素淬灭活性最强、与靶蛋白结合牢固且安全性良好。在125、62.5、31.25与15.625 μg/mL系列亚抑菌浓度下，异荭草素对S01生长无显著影响，却显著抑制生物膜形成、EPS产生、胞外蛋白酶与脂肪酶活性、运动性及C4-HSL分泌，最佳抑制效果出现在1/2 MIC。4 °C贮藏中125 μg/mL异荭草素有效延缓熏鸡腿理化性质与品质劣变、减慢腐败进程。该研究为开发新型天然QS淬灭剂、延长肉制品货架期提供了理论基础。
编译者解读：本研究走的是"虚拟筛选—体外淬灭验证—食品模型"的短链条路径，把中药小分子直接对准LuxI/LuxR双靶点，省去了传统抗菌剂开发中的大量盲筛成本。亮点在于用ADMET提前剔除靛玉红、靛蓝这类毒性分子，避免后期返工。局限也明显：异荭草素半衰期长达196.60 h，在食品体系中的残留与感官影响尚未评估；分子动力学仅100 ns，长期构象稳定性证据偏弱。若能与食品级递送载体结合，其应用价值会更高。
参考来源
期刊：International Journal of Food Microbiology, 2027
DOI: 10.1016/j.ijfoodmicro.2026.112045
DOI: 10.1016/j.ijfoodmicro.2026.112045