来源：Imaging diffusion of quorum sensing molecule using aptasensors（Sensors and Actuators B: Chemical）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
微生物通过分泌群体感应信号分子实现细胞间通讯，但信号分子在复杂介质中的时空分布一直难以直接观测。本研究将C4HSL结合适配体固定在纳米多孔阳极氧化铝膜上，构建跨膜阻抗型适配体传感器，在模拟土壤水凝胶中对C4HSL的局部浓度进行实时监测，并结合有限元模型反演扩散系数、重建四维浓度分布，最后用表达GFP的铜绿假单胞菌生物传感器进行验证。检测限10 nM，动态范围15–1000 nM。
研究背景
群体感应分子是微生物分泌的胞外信号，决定群落结构与功能。C4HSL（N-丁酰基-L-高丝氨酸内酯）是其中一类重要的信号分子。要理解它在多孔、非均相介质（如土壤）中如何扩散、如何形成浓度梯度，仅靠终点取样或荧光报告菌株难以获得定量的时空数据。常规电化学传感多在缓冲液中工作，难以嵌入水凝胶这类支撑微生物生长的软材料中。作者此前发展了基于纳米多孔阳极氧化铝（NAAO）膜的适配体传感器，利用适配体与靶标结合引起的跨膜阻抗变化进行检测。本文把这一平台移植到土壤模拟凝胶中：在同一张膜上制作多个传感器，贴在凝胶表面，追踪从圆形腔室向外扩散的C4HSL，并用计算模型把点测量扩展为四维浓度场。研究还对比了商用恒电位仪与低成本便携式阻抗读取器的性能差异，为未来田间部署提供依据。
研究方法
1.1 试剂与材料
C4HSL（CAS号98426–48–3，希尔式C8H13NO3）与3-oxo-C12HSL（CAS号168982–69–2，希尔式C16H27NO4），以及1,6-巯基己醇（MCH）（CAS号1633–78–9）均购自Sigma-Aldrich。巯基化C4HSL结合适配体ALSAP-8（Oligo 35C4HSL1A）[78]，序列为5'-ThioMC6-D-CGCTGCCCCCTGTCCTGGGTTAGCTAGCGAGAGCG-3'；以及巯基化阿莫地喹结合适配体OR7[79]，序列为5'-ThioMC6-D-CAAGGAAAATCCTTCAACGAAGTGGG-3'，均订购自Integrated DNA Technologies（IDT）。所有传感实验均在合成土壤盐混合物电解质（SSMB1：2 mM MgSO4、10 mM KCl、1 µM H3BO3、366 µM CaCl2、3 µM CuSO4、5 µM MnSO4、27 µM KI、33 µM KOH、83 µM KH2PO4、1 µM ZnSO4、103 µM Fe(III)Na-EDTA、68 µM MgSO4、23 µM Mg(NO3)2、94 µM MgCl2、64 µM NaCl、75 µM NH4CH3CO2）中进行，室温下用KOH将pH调至5.9[80]。所有溶液均用Corning Mega-Pure系统制备的双蒸水（ddH2O）配制。具有两种不同直径非对称孔结构的纳米多孔阳极氧化铝（NAAO）膜（25 mm与50 mm）、银环氧树脂和银丝购自Sigma-Aldrich。两种NAAO膜厚度均为50 μm，具有非对称孔结构：约1 μm厚的细孔层（平均孔径20 nm）由厚多孔层（孔径200 nm）支撑。基于Analog Instruments芯片（ADuCM350）的微处理器电化学阻抗读取器[77]用于监测膜阻抗变化。此外，使用恒电位仪（型号：Reference 600+，Gamry Instruments Inc.）与电化学多路复用器（型号：ECM8，Gamry Instruments Inc.）监测膜阻抗变化。
【数据】试剂：C4HSL（CAS 98426–48–3）、3-oxo-C12HSL（CAS 168982–69–2）、MCH（CAS 1633–78–9）；适配体浓度：1 µM；MCH浓度：3 mM；缓冲液pH：5.9；膜厚：50 μm；细孔层：约1 μm，平均孔径20 nm；支撑层孔径：200 nm；金层厚度：80 nm
1.2 换能器制作与适配体传感器响应校准
换能器采用与我们此前工作[42]类似的工艺制备。简述如下：用双蒸水和乙醇清洗非对称NAAO膜的正反两面，并溅射镀覆80 nm厚的金层。25 mm直径NAAO膜的表面被金膜完全覆盖，形成单个换能器，如图1(A)所示。50 mm直径膜的前表面镀有三条等间距、宽10 mm的条状金膜，构成三个适配体传感器的工作电极，如图1(B)所示；后表面镀金膜，作为三个适配体传感器的公共背电极。镀金非对称膜的横截面及前表面细孔层细节如图1(C)所示。随后用银环氧树脂连接导线，确保正反表面的金膜作为测量跨膜电化学阻抗的两个电极。将膜浸入1 µM巯基化35C4HSL1A或1 µM巯基化OR7适配体溶液中，储存过夜（约17 h），通过硫-金（-S-Au-）键将所需适配体固定于金表面。最后，将膜浸入3 mM MCH中1 h，回填剩余的金覆盖表面并去除物理吸附的适配体。适配体功能化步骤示意于图1(D)。
【数据】金层厚度：80 nm；条状金膜宽度：10 mm；适配体浓度：1 µM；固定时间：约17 h；MCH浓度：3 mM；MCH处理时间：1 h；膜直径：25 mm与50 mm
1.3 适配体传感器校准
将适配体包覆的膜安装于电化学池中，前表面连接工作/工作感测电极，后表面连接对/参比电极，如图1(E)所示。对于特异性结合实验，将适配体传感器暴露于15至1000 nM的C4HSL浓度范围，在每个浓度下进行三次1–10,000 Hz的电化学阻抗谱（EIS）扫描，测量膜正反表面之间的阻抗。使用商用恒电位仪（Gamry Ref 600 Plus）和基于微控制器的便携式阻抗读取器[77]监测跨膜阻抗变化。按照类似实验流程进行两组不同的对照实验——35C4HSL1A功能化膜暴露于3-oxo-C12HSL，以及OR7功能化膜暴露于C4HSL——以表征各适配体传感器对非特异性结合的响应。还测量了适配体传感器对重复注射纯缓冲液的响应，以表征噪声阈值。
【数据】C4HSL浓度范围：15–1000 nM；EIS频率范围：1–10,000 Hz；扫描次数：3次；对照分子：3-oxo-C12HSL；对照适配体：OR7
1.3.1 C4HSL在模拟土壤凝胶中的扩散
用校准后的适配体传感器监测C4HSL在土壤盐模拟凝胶（SSMgel）中的扩散，该凝胶由SSMB1溶液以0.96%植物凝胶和0.24%海藻酸盐固化而成。SSMgel与50 mm直径NAAO膜上形成的三个适配体传感器按如下方式布置：三个适配体传感器的中心分别距直径5 mm的C4HSL引入腔室中心10 mm、30 mm和50 mm，如图2A所示。带有三个适配体传感器的膜夹在两块凝胶之间，确保膜孔被凝胶液体浸润，从而实现跨膜电化学阻抗测量。将凝胶上的适配体传感器连接至恒电位仪和阻抗监测设备的要求，导致凝胶表面暴露于环境空气。我们关于环境条件下风干失重的初步实验表明，装置中所用水凝胶在前8 h内失水极少，但20 h后可检测到质量损失。因此，适配体传感器扩散监测的持续时间限制为2 h，以防止环境条件下缓慢风干在实验期间显著改变水凝胶性质。为追踪C4HSL穿过凝胶的过程，将100 µL高浓度C4HSL溶液引入腔室，并使用两种不同的阻抗读取器配置监测三个适配体传感器的响应。对1、10和100 mM的C4HSL浓度，每种配置下扩散测量重复两次。在第一种配置中，配备多路复用器的Gamry恒电位仪对每个适配体传感器进行EIS测量，电压扰动10 mV，频率1至10,000 Hz，监测传感器正反表面之间的阻抗变化。多路复用测量确保每个适配体传感器的阻抗以18分钟间隔测定。在第二种配置中，使用基于ADuCM350的阻抗读取器在窄频率范围内测量每个传感元件的阻抗。因此，每个传感元件的阻抗以1分钟间隔测量。
【数据】凝胶组成：0.96%植物凝胶+0.24%海藻酸盐；腔室直径：5 mm；传感器位置：10、30、50 mm；引入体积：100 µL；C4HSL浓度：1、10、100 mM；重复次数：2次；监测时长：2 h；风干实验：前8 h失水极少，20 h后可见失重；配置一：10 mV扰动，1–10,000 Hz，18 min间隔；配置二：1 min间隔
1.4 以细菌菌株作为生物传感器成像C4HSL扩散
细菌在基于SSMgel的生长培养基中培养，补充5 mM葡萄糖作为碳源。从固化培养基中心移除一个7.5 mm的孔，填充不同浓度的C4HSL水溶液。使用铜绿假单胞菌菌株YL100（rhlI-，rhlA-gfp：PAO1衍生物）作为生物传感器检测外源供给的C4HSL[81]。YL100不能产生内源C4HSL，但当感知到外源C4HSL时，会从PrhlA-gfp转录融合体表达GFP。自诱导物C4HSL结合RhlR转录调控因子，控制包括rhlA启动子在内的多种群体感应调控启动子的表达。将培养物稀释至600 nm光密度0.1，然后以螺旋图案点样到带中心孔的培养皿上。培养皿孵育18 h以确保GFP充分表达，然后用Dark Reader蓝光透射仪成像以评估GFP产生。
【数据】碳源：5 mM葡萄糖；中心孔直径：7.5 mm；菌株：铜绿假单胞菌YL100（rhlI-，rhlA-gfp）；接种OD600：0.1；孵育时间：18 h；成像设备：Dark Reader蓝光透射仪
研究结果
2.1 C4HSL适配体传感器校准
将适配体传感器暴露于15至1000 nM的浓度范围，以确定其在SSMB1缓冲液中对C4HSL的响应。C4HSL浓度为0 nM和500 nM时测得的适配体传感器阻抗幅值和相位的代表性曲线绘于图3A。如图所示，暴露于C4HSL后适配体传感器阻抗降低，表明C4HSL/适配体结合影响了适配体传感器响应。阻抗数据拟合为弛豫时间分布（DRT）[67,82,83]，所得曲线示于图3B。DRT分布图显示，适配体传感器阻抗在弛豫时间约0.001 s或1000 Hz处的峰幅值降低，将峰高降低量乘以−1并用初始峰高归一化，作为对500 nM C4HSL浓度的适配体传感器响应[77,80]。符号变化确保暴露于分析物时DRT峰高的降低表现为正的适配体传感器响应，便于解读和绘图。对15、50、100、150、200、500、1000 nM C4HSL浓度各测量三次适配体传感器响应，绘于图3C，标记为35C4HSL1A + C4HSL，即适配体-分析物组合。适配体传感器响应幅值随C4HSL浓度增加而增大，并在约1000 nM处达到饱和。适配体传感器响应拟合于Langmuir等温线：
(1) aptasensor response = −ΔR/R = Fmax * C/(C + KD)
其中Fmax为最大适配体传感器响应，C为C4HSL浓度，KD为解离常数。适配体传感器响应的拟合曲线绘于图3C，Fmax和KD值分别为10.5%和约70 nM。空白响应至少测量9次，变化范围在−0.03%至0.03%之间，标准差为0.01%。完整响应范围绘于图3C。基于拟合和空白响应，检测限（LOD）估计为10 nM。LOD由空白响应变异性和校准关系确定；因此报告值代表在这些实验条件下估计可与实测空白响应区分的最小C4HSL浓度。还使用便携式阻抗读取器[77]在相同浓度范围内测量适配体传感器响应，测量结果包含在支持信息图S1中。便携式阻抗读取器测得的响应显示KD值相似，约70 nM，但Fmax幅值较低，等于8%。使用便携式恒电位仪的传感测量估计检测限（LOD）为30 nM。Zhao等[78]监测了表面固定35C4HSL1A适配体与C4HSL的结合，报告估计KD为25–30 nM。然而，支持信息图S3中包含的C4HSL与35C4HSL1A溶液结合的等温滴定量热（ITC）表征表明溶液结合亲和力较低，估计KD为600–1000 nM。表面固定适配体与C4HSL的结合具有显著更高的亲和力（更低的表观Kd），这与其他表面固定适配体的观察结果一致[42,77,80]。溶液与表面测得KD的差异可能源于固定适配体的可及性和有效结合位点密度。便携式阻抗读取器只能在较小频率范围内测量阻抗，因此计算的DRT峰变化幅值较小，但阻抗测量可在显著更短时间内完成（30 s，而恒电位仪测量为8 min）。减小的频率带宽也限制了可分辨的弛豫时间分布部分，这可能降低重建DRT响应的幅值和重现性。因此，便携式读取器以增加噪声和降低响应幅值为代价提供更快的采集。更宽带宽的信号分析仪硬件和改进的DRT重建有望在未来现场实施中提高定量性能。进行了两组不同的对照实验，以确保适配体传感器响应对C4HSL的存在具有特异性。在第一组实验中，将适配体传感器暴露于不同浓度的3-oxo-C12HSL，测得的阻抗及相关DRT曲线包含在支持信息S2中。适配体传感器对3-oxo-C12HSL的响应（3次不同实验的平均值）绘于图3C，标记为35C4HSL1A + 3-oxo-C12HSL。适配体传感器阻抗随3-oxo-C12HSL浓度增加而增大，但适配体传感器响应幅值在空白响应范围内。Zhao等[78]证明C4HSL结合适配体（35C4HSL1A）对3-oxo-C12HSL无亲和力，这些结果表明适配体传感器响应也对C4HSL具有特异性。在第三组实验中，适配体传感器用阿莫地喹结合适配体（OR7）[77]功能化，阿莫地喹适配体传感器暴露于C4HSL的响应（3次不同响应的平均值）绘于图3C，标记为OR7 + C4HSL响应。阿莫地喹适配体传感器的阻抗增加导致负的适配体传感器响应，但响应幅值接近空白响应范围。当前实验证明了对所测试对照的选择性，但并未穷尽性地确立对所有结构相关HSL或真实根际环境中存在的化合物的选择性。混合分析物和更广泛干扰物的研究将在未来工作中具有重要意义。C4HSL的平均适配体传感器响应作为C4HSL浓度的函数绘于图3D的半对数图中，以表示图3(D)中测量的动态范围。测量值的标准差作为误差棒绘于图中。适配体传感器测量值随C4HSL浓度对数呈线性趋势，表明动态范围为15至1000 nM。pH 6.0时带负电的适配体与中性C4HSL分子的结合，预期导致其从游离态下灵活、动态的构象集合转变为结合态下稳定的二级结构。适配体分子与C4HSL特异性结合时的构象转变预期会改变表面电荷分布，导致观察到的膜阻抗随C4HSL浓度增加而降低。Capatina等[84]也报道了在功能化金表面上使用不同适配体/高丝氨酸内酯组合的传感实验中，特异性结合导致表面阻抗降低。因此，特异性C4HSL结合时适配体传感器阻抗的降低可能与孔内和膜表面上适配体的特异性结合诱导构象转变有关。
【数据】C4HSL浓度：15、50、100、150、200、500、1000 nM；Fmax：10.5%（恒电位仪）、8%（便携式读取器）；KD：约70 nM（两种读取器）；空白响应范围：−0.03%至0.03%；空白标准差：0.01%；空白测量次数：≥9次；LOD：10 nM（恒电位仪）、30 nM（便携式）；动态范围：15–1000 nM；ITC测得溶液KD：600–1000 nM；文献报道表面KD：25–30 nM；测量时间：30 s（便携式）vs 8 min（恒电位仪）；DRT峰弛豫时间：约0.001 s / 1000 Hz
2.2 监测C4HSL扩散
在凝胶腔室中引入C4HSL溶液后，监测分别安装在距腔室10、30和50 mm处的三个适配体传感器1、2和3的响应。在每个实验中，将小体积（100 µL）毫摩尔浓度溶液引入凝胶腔室，对三种C4HSL浓度（1 mM、10 mM和100 mM）各重复两次实验。在远离凝胶腔室的三个不同位置监测适配体传感器附近C4HSL局部浓度的变化。
【数据】传感器位置：10、30、50 mm；引入体积：100 µL；C4HSL浓度：1、10、100 mM；重复次数：2次
讨论与解读
作者用适配体传感器在模拟土壤凝胶中追踪了群体感应信号分子C4HSL的扩散。每个传感器以C4HSL结合适配体功能化，检测并定量局部C4HSL浓度。特异性结合C4HSL时适配体传感器阻抗降低，对非特异性结合分子则响应与噪声不可区分。检测限10 nM，动态范围15–1000 nM。商用恒电位仪与低成本便携式阻抗读取器[77]测得相似的适配体传感器响应。便携式读取器噪声更大、LOD更高（30 nM），但重复测量间的循环时间更短。利用基于适配体传感器的不同距离局部C4HSL浓度测量，监测了C4HSL从凝胶腔室的扩散。用恒电位仪和阻抗读取器测定的局部浓度，在按引入凝胶腔室的浓度归一化后坍缩为单一曲线。将分子在凝胶中扩散方程的有限元解拟合实验局部浓度测量值，估计C4HSL在模拟土壤凝胶中的扩散参数。估计的扩散参数与文献报道的……（原文此处截断）
编译者解读：把适配体传感器从缓冲液"搬进"水凝胶，是这项工作最见功力的地方——它让群体感应信号从终点荧光照片变成可定量的时空数据。多传感器单膜集成加有限元反演，思路清晰；但2 h监测窗口受风干限制，且选择性只验证了两种对照分子，真实根际的混合干扰尚未覆盖。便携读取器的噪声代价也提示：田间部署前，硬件带宽与DRT重建仍需打磨。
参考来源
期刊：Sensors and Actuators B: Chemical, 2027
DOI: 10.1016/j.snb.2026.141049
DOI: 10.1016/j.snb.2026.141049