来源：Advancing Terpenoid Biosynthesis in Saccharomyces cerevisiae: Synthetic Biology Approaches for Efficient Longifolene Production（Metabolic Engineering）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
长叶烯（longifolene）是一种高能量密度的倍半萜，被视为潜在的生物燃料与高值萜类化合物。微生物合成受限于酶催化效率、辅因子供给和前体供应三大瓶颈。本研究在酿酒酵母中构建了催化模块、NADPH再生模块与前体供给模块协同优化的系统代谢工程框架：以RIDD/RIAD肽介导的酶组装与结构导向的psTPS突变体筛选强化催化，以异源FDH引入叠加内源戊糖磷酸途径通量缓解NADPH失衡，以NOG通路整合与转录抑制因子敲除重编程中心碳代谢。最终菌株摇瓶产量达92.84 mg/L，5 L补料分批发酵204 h总长叶烯达4181.51 mg/L。
研究背景
萜类化合物是源自植物、微生物和昆虫的一大类天然产物，骨架多样，广泛用于医药、香精、食品添加剂、农药和生物燃料等领域。按碳原子数可分为半萜（C5）、单萜（C10）、倍半萜（C15）、二萜（C20）和三萜（C30）等。青蒿素是抗疟药物，柠檬烯与α-蒎烯是有效的天然杀虫剂，长叶烯则因能量密度高被视为潜在生物燃料。植物提取与化学合成面临收率低、成本高、污染环境等问题，限制了产业化。以微生物尤其是酿酒酵母为细胞工厂进行萜类生物合成因而成为重要方向。酿酒酵母具有GRAS地位、成熟的遗传操作工具、高效的葡萄糖利用能力和完整的甲羟戊酸（MVA）通路，被广泛视为理想宿主。MVA通路是萜类合成的核心途径，但其通量受酶催化效率、NADPH供给与乙酰辅酶A前体供应等多层限制，单一靶点的改造往往难以奏效。本研究据此提出催化模块、辅因子模块与前体模块协同优化的系统策略。
研究方法
2.1 菌株与质粒
本研究所用起始菌株为实验室保藏的酿酒酵母L17（S. cerevisiae L17）。经密码子优化的长叶烯合酶基因及其他通路基因被克隆至酵母表达质粒或基因组整合盒中，具体信息见补充表S1与S2。补充表S1和S2提供了质粒骨架、相关表达盒、启动子、筛选标记、拷贝数状态以及适用的基因组整合位点。重组质粒采用标准醋酸锂转化法导入宿主菌株。基因组整合模块被导入指定基因座，并通过菌落PCR和/或测序验证。转化子在含相应筛选标记的固体培养基上筛选，获得重组工程酵母菌株。八个匹配的C × N × P菌株的基因型与因子编码见补充表S2。
【数据】菌株：S. cerevisiae L17；转化方法：标准醋酸锂转化法；验证方法：菌落PCR和/或测序；培养基：含相应筛选标记的固体培养基；质粒与整合位点信息：见补充表S1、S2
2.2 摇瓶发酵
将重组酵母的纯化单菌落接种至含50 mL筛选培养基的试管中，30 °C振荡培养12–16 h。当培养液在600 nm处的光密度（OD600）达到1–2时，于4 °C、3000 × g离心3–4 min收集细胞。弃去上清后，将细胞沉淀重悬于无菌双蒸水（ddH2O）中，转接至含30 mL培养基的摇瓶，使初始OD600约为0.1。发酵24 h后，按培养体积的15%（v/v）加入正壬烷进行产物原位萃取。发酵共持续120 h，期间定期取样，分离有机相用于产物分析。除另有说明外，摇瓶实验使用三个独立接种、独立培养的生物学重复（n = 3）。
【数据】接种体积：50 mL筛选培养基；种子培养温度：30 °C；种子培养时间：12–16 h；初始OD600：约0.1；发酵装液量：30 mL；萃取剂：正壬烷；萃取剂添加量：15%（v/v）；萃取剂添加时间：发酵24 h；发酵时长：120 h；生物学重复：n = 3
2.3 补料分批发酵
将重组酵母的纯化单菌落进行两级种子培养。首先接种至含50 mL筛选培养基的试管中，30 °C振荡培养12–16 h（一级种子）。随后按8%–10%（v/v）接种量转接至含50 mL培养基的250 mL摇瓶中，30 °C继续培养24–48 h（二级种子）。二级种子培养液于4 °C、3000 × g离心3–4 min收集细胞，用100 mL无菌ddH2O洗涤后，接种至含2 L初始培养基的5 L生物反应器，使初始OD600为0.5。发酵参数维持如下：温度30 °C（循环冷却水控制）、pH 5.0（自动补加KOH溶液）、通气量2 vvm。发酵液中葡萄糖与乙醇浓度通过高效液相色谱（HPLC）监测。当两种底物均耗尽至检测限以下时启动补料。发酵72 h时，按培养体积的10%（v/v）加入聚α-烯烃进行产物原位萃取。共进行三次独立的5 L补料分批发酵。
【数据】一级种子：50 mL、30 °C、12–16 h；二级种子：50 mL/250 mL摇瓶、接种量8%–10%（v/v）、30 °C、24–48 h；生物反应器体积：5 L；初始培养基体积：2 L；初始OD600：0.5；温度：30 °C；pH：5.0（KOH自动调节）；通气量：2 vvm；补料触发条件：葡萄糖与乙醇均低于检测限；萃取剂：聚α-烯烃；萃取剂添加量：10%（v/v）；萃取剂添加时间：72 h；独立发酵次数：3
2.4 分析方法
#### 2.4.1 生物量测定
发酵过程中每12 h取样一次。适当稀释后，使用紫外-可见分光光度计于600 nm测定光密度（OD600）以监测细胞生长。
【数据】取样间隔：12 h；检测波长：600 nm；仪器：紫外-可见分光光度计
#### 2.4.2 长叶烯定量
分别收集每个摇瓶生物学重复或补料分批发酵批次的上层有机相用于长叶烯分析。样品于12,000 × g离心1 min，上清液经GC-MS分析（进样口温度250 °C；载气为高纯氦气，流速1 mL/min；离子源温度200 °C；质量扫描范围m/z 50–300）。长叶烯通过保留时间与真实标准品（约4.28 min）比对及NIST库匹配进行鉴定。定量采用外标校准曲线而非内标法；4、10、25、50和125 mg/L的标准溶液在相同GC-MS条件下分析，以峰面积对长叶烯浓度作图。于120 h（摇瓶）或补料分批发酵结束时（5 L生物反应器）取样5 mL发酵液。于4 °C、3000 rpm离心3 min收集细胞，收集上层有机相用于胞外长叶烯定量。细胞沉淀用1 mL ddH2O洗涤三次，使用超声波细胞破碎仪（SCIENTZ-IID，宁波新芝）以20%功率、3 s开/5 s停循环破碎5 min。胞内长叶烯用1 mL正壬烷萃取三次。合并有机相，涡旋并12,000 rpm离心1 min，收集上层，稀释10倍后GC-MS分析。胞内浓度按Ccell = (Cmeasured × 稀释倍数 × 总萃取体积) / 样品体积回算，并以DCW归一化。总长叶烯滴度为上层有机相胞外滴度与同体积基准胞内滴度之和，203 h时总计4,181.51 mg/L。每个样品分析三个独立生物学重复和三个技术重复。
【数据】GC-MS进样口温度：250 °C；载气流速：1 mL/min（高纯氦气）；离子源温度：200 °C；质量扫描范围：m/z 50–300；长叶烯保留时间：约4.28 min；标准曲线浓度点：4、10、25、50、125 mg/L；取样体积：5 mL；离心条件：4 °C、3000 rpm、3 min；超声功率：20%；超声循环：3 s开/5 s停、5 min；萃取剂：正壬烷；萃取体积：1 mL×3次；稀释倍数：10倍；总滴度：4,181.51 mg/L（203 h）；生物学重复：3；技术重复：3
#### 2.4.3 葡萄糖与乙醇测定
分别收集每个摇瓶生物学重复或补料分批发酵批次的下层水相用于底物与副产物分析。样品于12,000 × g离心1 min，上清液经HPLC分析。HPLC条件如下：柱温65 °C；流动相为5 mM硫酸水溶液，流速0.6 mL/min；进样体积10 μL。葡萄糖与乙醇通过与标准品保留时间比对进行定性，并使用相应校准曲线定量。
【数据】柱温：65 °C；流动相：5 mM硫酸水溶液；流速：0.6 mL/min；进样体积：10 μL；离心条件：12,000 × g、1 min
#### 2.4.4 胞内NADPH/NADP+比值与乙酰辅酶A水平测定
为评估辅因子再生与碳通量工程的生理效应，在代表性逐步工程化菌株中测定胞内NADPH/NADP+比值与乙酰辅酶A水平。于指定发酵时间点收集细胞，快速淬灭并按相应检测方案提取。NADPH与NADP+含量使用商业检测试剂盒测定，NADPH/NADP+比值由实测浓度计算。胞内乙酰辅酶A通过液相色谱-质谱联用（LC-MS）定量，并以干细胞重（DCW）归一化。每个菌株在每个指定取样时间分析三个独立生物学重复（n = 3）。
【数据】检测指标：NADPH/NADP+比值、乙酰辅酶A；NADPH/NADP+测定方法：商业检测试剂盒；乙酰辅酶A测定方法：LC-MS；归一化基准：DCW；生物学重复：n = 3
#### 2.4.5 角鲨烯与麦角固醇定量
于120 h收集R00、R01和R02菌株样品，取相当于5 mL发酵液的细胞，于4 °C、3000 rpm离心3 min，用ddH2O洗涤两次，经超声波细胞破碎（SCIENTZ-IID，宁波新芝）后，用含0.2%焦性没食子酸的甲醇溶液与60% KOH（1:1，v/v）于75 °C皂化1.5 h。角鲨烯与麦角固醇用2 mL正己烷萃取三个循环。合并萃取液使用配备HP-5MS毛细管柱的Agilent 7890A-5975MS GC-MS分析，程序如下：进样口温度250 °C，氮气为载气、流速1 mL/min，离子源温度200 °C，50–300 Da全扫描。定量使用角鲨烯与麦角固醇标准品，校准范围4–125 mg/L；未测定回收率。分析三个独立生物学重复。含量按(GC测得质量 / 样品体积) × (总萃取体积 / DCW)计算，并以DCW归一化。
【数据】取样时间：120 h；取样体积：5 mL发酵液；离心条件：4 °C、3000 rpm、3 min；皂化试剂：0.2%焦性没食子酸甲醇溶液与60% KOH（1:1，v/v）；皂化温度：75 °C；皂化时间：1.5 h；萃取剂：正己烷；萃取体积：2 mL×3循环；GC-MS型号：Agilent 7890A-5975MS；色谱柱：HP-5MS；进样口温度：250 °C；载气：氮气、1 mL/min；离子源温度：200 °C；扫描范围：50–300 Da；标准曲线范围：4–125 mg/L；生物学重复：3
#### 2.4.6 模块贡献与碳平衡相关参数计算
代表性逐步工程化菌株在相同摇瓶发酵条件下进行比较。葡萄糖消耗、乙醇生成、生物量积累……（原文节选至此）
【数据】比较条件：相同摇瓶发酵条件；检测指标：葡萄糖消耗、乙醇生成、生物量积累；原文未详述后续参数
研究结果
3.1 酶组装与结构导向的psTPS优化
长叶烯是松属植物微量产生的倍半萜次级代谢产物，其专用萜烯合酶内在催化活性低，成为异源生产的 major 瓶颈。本研究将法尼基焦磷酸合酶基因ERG20与长叶烯合酶基因psTPS通过RIDD-RIAD酶组装系统融合，构建底物通道化代谢支架。该策略在测试条件下提高了全细胞长叶烯产量。由于FPP转移、局部FPP浓度、非酶损失及psTPS内在动力学均未被直接测定，该结果尚不能确立底物通道化或内在催化效率提升。此外，对psTPS进行定向突变以鉴定体内通路性能改善的变体，表现最佳变体的结构基础通过分子动力学分析进一步考察（图2及补充图5、6）。
【数据】融合基因：ERG20与psTPS；组装系统：RIDD-RIAD；突变方式：定向突变；结构分析：分子动力学；原文未详述具体产量数值
#### 3.1.1 ERG20与psTPS的组装
为优化ERG20与psTPS的协同催化，我们实施了两套不同的蛋白支架系统：SpyTag/SpyCatcher与RIDD/RIAD。与常规直接融合或柔性连接肽不同，这些支架依赖高度特异的分子识别与结合，精确控制酶化学计量比与空间邻近，从而改变酶邻近性与化学计量，可能影响全细胞通路性能。发酵结果显示，引入任一蛋白支架系统对宿主细胞生长均无实质性影响（图3a）。然而，它们对长叶烯生物合成的影响差异显著。表达SpyTag/SpyCatcher支架的菌株（R01）长叶烯滴度较对照下降，可能归因于较大的SpyCatcher结构域（113个氨基酸）及其通过延展柔性连接肽与目标酶相连，导致活性位点空间分离过度，无法形成功能性酶簇，并可能破坏天然酶构象或亚细胞定位。相反，整合RIDD/RIAD支架的菌株（R02）长叶烯产量大幅提高36%（图3b）。该结果符合预期：在RIDD/RIAD系统中，RIAD标记的ERG20与RIDD标记的psTPS以2:1化学计量比组装。鉴于psTPS通常被认为是该双酶系统的限速步骤，RIDD/RIAD配置与更高的长叶烯滴度及更低的终点角鲨烯和麦角固醇池相关联。这些终点数据与FPP衍生代谢物分配改变相一致，但不能直接证明FPP通道化、ERG20向psTPS的转移或通路通量增加。120 h终点测定显示，R02长叶烯滴度高于R00（74.95 ± 2.75 对 55.10 ± 2.30 mg/L），终点角鲨烯（1.46 ± 0.12 对 1.82 ± 0.14 mg/g DCW）与麦角固醇池（8.19 ± 0.38 对 8.72 ± 0.41 mg/g DCW）更低（补充图S11）。这些终点池与FPP衍生代谢物分配改变相一致。
【数据】支架系统：SpyTag/SpyCatcher（R01）、RIDD/RIAD（R02）；SpyCatcher结构域：113个氨基酸；RIDD/RIAD组装比例：2:1；R02长叶烯滴度：74.95 ± 2.75 mg/L；R00长叶烯滴度：55.10 ± 2.30 mg/L；R02较对照提升：36%；R02角鲨烯：1.46 ± 0.12 mg/g DCW；R00角鲨烯：1.82 ± 0.14 mg/g DCW；R02麦角固醇：8.19 ± 0.38 mg/g DCW；R00麦角固醇：8.72 ± 0.41 mg/g DCW；测定时间：120 h
#### 3.1.2 结构导向的psTPS变体评估
为鉴定体内通路性能改善的psTPS变体，我们使用深度学习框架EITLEM-Kinetics对候选突变进行优先级排序以供实验评估。所有突变质粒均经测序验证并转化至生产菌株进行发酵验证。在测试变体中，S433A平均终点长叶烯滴度最高，较野生型psTPS对照高约22%（图4b）。由于psTPS与S433A的直接体外动力学测定在测试条件下重复性不足，我们基于发酵性能结合结构分析解读S433A效应，而非报告不可靠的Km或kcat值。结构建模与分子动力学分析显示，残基433位于靠近底物结合口袋的环区。S433A突变并非简单稳定整体活性口袋，而是改变了近底物口袋的局部构象集合。与野生型psTPS相比，S433A增加了闭合/生产性构象的比例，并降低了C15/C14/C12反应核心区域的水占据（补充图5）。结构比较进一步提示底物结合口袋周围的局部重排（补充图6）。这些结果提示S433A可能有利于更具催化兼容性的局部微环境，尽管在测试的体外测定条件下无法可靠确定直接动力学参数。
【数据】变体：S433A；筛选框架：EITLEM-Kinetics；S433A终点滴度较野生型提升：约22%；突变位点：残基433（环区，近底物结合口袋）；分析指标：闭合/生产性构象比例、C15/C14/C12反应核心区水占据；Km/kcat：原文未详述（体外测定重复性不足）
3.2 辅因子再生优化
NADPH是萜类生物合成的核心还原力，驱动多个关键反应。首先，在MVA通路中，NADPH为HMG-CoA还原酶催化的HMG-CoA向甲羟戊酸转化提供必需还原当量，甲羟戊酸是异戊烯基焦磷酸（IPP）与二甲基烯丙基焦磷酸（DMAPP）——所有萜类的基本构建单元——的直接前体。其次，在MVA通路中，NADPH为HMG-CoA还原酶催化的HMG-CoA向甲羟戊酸转化所必需，从而支持IPP、DMAPP及最终用于长叶烯生物合成的FPP的供应。为缓解胞内NADPH限制，我们将异源FDH引入酿酒酵母基因组以提供稳定的还原力来源。在此基础上，我们过表达了八种内源NADPH再生酶：琥珀酸半醛脱氢酶（UGA2）、苹果酸酶（MAE1）、胞质异柠檬酸脱氢酶（IDP2）、NADH激酶（POS5）、6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶（GND1和GND2）、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（ZWF1）以及6-磷酸葡萄糖酸内酯酶（SOL3），以全面提升胞内辅因子再生效率。FDH催化甲酸氧化为CO2并伴随NADPH再生，是提升胞内还原力的有力工具。摇瓶发酵实验表明，FDH基因组整合显著促进了工程菌株的细胞生长（图5a）。该观察不仅证实FDH支持萜类生物合成的有效性，也凸显其表达水平与宿主生理状态的紧密耦合。值得注意的是，这些实验未补充外源甲酸底物。既往研究表明酵母在葡萄糖代谢过程中产生痕量内源甲酸。该内源甲酸池可能贡献于FDH依赖的NADPH再生，但其贡献程度尚待定量。避免外源甲酸添加也可能降低工艺复杂性及潜在甲酸相关胁迫。对于酿酒酵母中八种内源NADPH再生酶，单独过表达每个基因对细胞生长均无实质性抑制（图6a）。然而，它们对长叶烯产量的影响差异显著：过表达UGA2、MAE1、IDP2、POS5和GND2导致产量下降，可能归因于中心碳通量分配扰动；相反，过表达戊糖磷酸途径相关酶GND1、ZWF1和SOL3导致不同程度的产量提升，其中SOL3过表达提升最为显著（图6b）。在上述筛选基础上，我们对三种最有效的PPP相关基因GND1、ZWF1和SOL3进行组合过表达。发酵结果显示，双基因组合进一步提高长叶烯产量，而三基因共表达菌株产量低于最佳双基因组合……（原文节选至此）
【数据】外源基因：FDH；内源过表达酶：UGA2、MAE1、IDP2、POS5、GND1、GND2、ZWF1、SOL3（共8种）；外源甲酸：未添加；产量下降的过表达基因：UGA2、MAE1、IDP2、POS5、GND2；产量提升的过表达基因：GND1、ZWF1、SOL3；提升最显著：SOL3；组合策略：GND1、ZWF1、SOL3双基因与三基因组合；三基因共表达产量：低于最佳双基因组合；原文未详述具体产量数值
3.3 前体供给模块（NOG通路与转录抑制因子敲除）
（原文结果节选未提供3.3节文字，按图表清单与摘要信息，此部分涉及NOG通路整合、PK/PTA同源物组合表达、DOS2与YNR063W敲除及最终整合菌株发酵验证。）
【数据】工程模块：NOG通路整合、PK/PTA同源物组合表达、DOS2与YNR063W敲除；最终菌株：R39；摇瓶长叶烯产量：92.84 mg/L；5 L补料分批总长叶烯：4181.51 mg/L（204 h）；胞外：3484.79 mg/L；胞内：696.72 mg/L；原文节选未详述各中间菌株具体数值
讨论与解读
本研究通过催化性能、NADPH再生与胞质乙酰辅酶A供给的协同优化，构建了产长叶烯的酿酒酵母平台。作者并未将各工程层次标榜为各自独立的新颖发现，而是强调针对长叶烯生物合成特定瓶颈的逐步选择与定量整合。酶模块层面，RIDD/RIAD介导的ERG20与psTPS组装改善了全细胞通路性能，预测指导的筛选鉴定出S433A为测试条件下长叶烯产量最高的psTPS变体；分子动力学分析与近底物口袋环境的局部重塑相一致，但未确立内在催化活性增强或动力学参数改变。辅因子工程进一步表明NADPH再生必须与碳分配平衡——PPP相关酶的双重强化提升产量，而过度的PPP激活反而削弱收益。同时，Lm-PK/Bs-PTA引入与更大的终点乙酰辅酶A池相关联，DOS2/YNR063W敲除与更高的长叶烯产量相关联并进一步支持长叶烯形成。最终工程菌株R39摇瓶发酵产92.84 mg/L长叶烯，在5 L脉冲补料分批生物反应器（2 L初始体积）中总长叶烯达4181.51 mg/L。
编译者解读：该研究的价值在于把"酶邻近性—辅因子—前体"三个常被分开处理的瓶颈放进同一菌株做定量叠加，尤其RIDD/RIAD的2:1化学计量设计贴合psTPS限速的现实。但作者对底物通道化与动力学参数保持克制，未用终点池数据过度推论机制，这种审慎值得借鉴。局限在于摇瓶与反应器滴度差距近45倍，萃取与回收方案对总滴度贡献大，跨研究比较受限；PPP双基因与三基因的非加性效应也提示"越多越好"的堆叠逻辑在辅因子层面并不成立，后续需以通量分析而非终点浓度指导组合。
参考来源
期刊：Metabolic Engineering, 2026
DOI: 10.1016/j.ymben.2026.102577
DOI: 10.1016/j.ymben.2026.102577