来源：Discovery of bioactive inhibitors from complex natural products based on nanozyme biosensor（Microchemical Journal）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
从复杂天然产物中高效发现活性成分，一直是药物研发的瓶颈。本研究构建了一套"纳米酶比色传感器 + 计算机辅助虚拟筛选"的联用策略：先合成具有过氧化物酶样活性的Fe-共价有机框架（Fe-COF），据此建立黄嘌呤氧化酶（XOD）活性检测方法，在30种中药材提取物中快速锁定橡子具有显著抑制活性；再经分子对接与分子动力学模拟，从橡子82种候选化合物中筛出没食子酸焦性没食子素（purpurogallin），其抑制XOD的IC₅₀为177.67 μM，并在细胞水平验证了降尿酸作用。
研究背景
黄嘌呤氧化酶是嘌呤代谢的关键酶，催化次黄嘌呤与黄嘌呤氧化生成尿酸。其活性异常与痛风、高尿酸血症等疾病密切相关，因而成为治疗这些疾病的重要靶点。临床常用抑制剂别嘌醇和非布司他降尿酸效果强，但副作用难以回避：别嘌醇可引起发热、腹泻、肝炎乃至肾功能衰竭，非布司他则可能增加心血管疾病、急性肾损伤与过敏反应风险。
天然产物因结构新颖、生物活性多样、安全性较好而备受关注，复杂天然产物基质被认为是发现安全有效酶抑制剂的理想来源。但天然产物体系本身复杂，传统筛选方法又有局限，如何建立高效、灵敏、高特异性的筛选方法，成为药物发现领域亟待解决的问题。生物传感器将生物分子识别元件与物理化学信号转导结合起来，为这一难题提供了新的技术路径。本研究即在此基础上，把纳米酶比色传感与计算机辅助药物发现相衔接，尝试打通从"样品级活性初筛"到"分子级成分鉴定"的完整链条。
研究方法
2.1 材料与试剂
黄嘌呤氧化酶（XOD）、黄嘌呤、1,3,5-三(4-氨基苯基)苯（TAPB）、均三甲苯、1,4-二氧六环和三氟甲磺酸亚铁（Fe(OTf)₂）购自Energy Chemical有限公司（中国上海）。3,3′,5,5′-四甲基联苯胺（TMB）、乙酸、虎杖苷、扎那米韦、氨苄西林钠和阿加曲班购自阿拉丁生化科技有限公司（中国上海）。3,3′-联吡啶-6,6′-二甲醛（BPA）购自麦克林生化科技有限公司（中国上海）。三十种不同天然产物购自当地中药材市场。其余化学试剂均为分析纯，由当地供应商提供。
【数据】试剂：XOD、黄嘌呤、TAPB、均三甲苯、1,4-二氧六环、Fe(OTf)₂、TMB、乙酸、虎杖苷、扎那米韦、氨苄西林钠、阿加曲班、BPA；天然产物：30种；纯度等级：分析纯；原文未详述其余试剂用量
2.2 Fe-COF的合成
Fe-COF可在室温下通过快速缩聚反应合成。参照文献[46]总结的方法，将TAPB（28.35 mg，0.08 mM）、BPA（25.46 mg，0.12 mM）和Fe(OTf)₂（84.96 mg，0.24 mM）在1,4-二氧六环与均三甲苯的混合溶剂（1 mL，v/v = 1:1）中超声处理，形成均匀悬浮液。在冰乙酸（400 μL 6 M）存在下，混合物于室温静置数分钟，生成棕褐色沉淀。所得粉末经离心收集，用四氢呋喃（THF）洗涤，随后于THF中浸泡24 h。产物最终真空干燥过夜，即得Fe-COF。
【数据】TAPB：28.35 mg（0.08 mM）；BPA：25.46 mg（0.12 mM）；Fe(OTf)₂：84.96 mg（0.24 mM）；混合溶剂：1,4-二氧六环/均三甲苯 1 mL（v/v = 1:1）；冰乙酸：400 μL（6 M）；反应温度：室温；静置时间：数分钟；THF浸泡：24 h；真空干燥：过夜
2.3 表征
采用透射电子显微镜（TEM，FEI Talos F200S）和扫描电子显微镜（SEM，Thermo Scientific Apreo 2S）表征Fe-COF的表面形貌与结构。采用X射线光电子能谱（XPS，Thermo Scientific K-ALPHA）分析Fe-COF的元素组成与价态。此外，采用傅里叶变换红外光谱（FT-IR，Tensor 27）分析Fe-COF的结构。电子顺磁共振（EPR）测量在Bruker EMXplus波谱仪上进行。
【数据】仪器：TEM（FEI Talos F200S）、SEM（Thermo Scientific Apreo 2S）、XPS（Thermo Scientific K-ALPHA）、FT-IR（Tensor 27）、EPR（Bruker EMXplus）；测试参数：原文未详述
2.4 Fe-COF的过氧化物酶模拟活性评价
以TMB为显色底物评价Fe-COF的仿酶活性。将含100 μL 0.03% H₂O₂、100 μL 1 mg/mL TMB和100 μL 100 μg/mL Fe-COF催化剂的反应混合液加入1 mL 0.2%乙酸溶液中。混合物于室温反应5 min。加入100 μL终止液终止催化反应。随后用紫外分光光度计测定450 nm处吸光度，并采集相应吸收光谱。稳态动力学测定在催化剂浓度100 μg/mL条件下进行，改变TMB与H₂O₂的浓度。通过将初始反应速率（v）拟合至Michaelis–Menten方程及相应Lineweaver–Burk双倒数图，确定米氏常数（Km）与最大反应速率（Vmax）。拟合方程表达为：v = Vmax × S / (Km + S)；1/v = Km / Vmax × S + 1 / Vmax，其中v为初始反应速率，Km为米氏常数，Vmax为最大速率，[S]为底物（TMB）浓度。
【数据】H₂O₂：100 μL（0.03%）；TMB：100 μL（1 mg/mL）；Fe-COF：100 μL（100 μg/mL）；乙酸：1 mL（0.2%）；反应温度：室温；反应时间：5 min；终止液：100 μL；检测波长：450 nm；动力学催化剂浓度：100 μg/mL
引入一系列清除剂，包括对苯醌（O₂⁻）、叔丁醇（·OH）和L-组氨酸（¹O₂），考察它们各自对TMB氧化过程的影响。具体步骤如下：测定在含700 μL 0.2%（v/v）乙酸、100 μL 10 mM清除剂、100 μL 0.03% H₂O₂、100 μL 1 mg/mL TMB和100 μL 100 μg/mL Fe-COF的水溶液中进行，随后室温孵育5 min。然后加入100 μL终止液终止催化反应。用紫外-可见分光光度法记录450 nm处吸光度，以考察活性氧（ROS）类型。
【数据】乙酸：700 μL（0.2%，v/v）；清除剂：100 μL（10 mM，对苯醌/叔丁醇/L-组氨酸）；H₂O₂：100 μL（0.03%）；TMB：100 μL（1 mg/mL）；Fe-COF：100 μL（100 μg/mL）；孵育温度：室温；孵育时间：5 min；终止液：100 μL；检测波长：450 nm
为研究合成Fe-COF的过氧化物酶模拟活性，进行了理论计算。DFT计算采用PBE方法、DND3.5基组，使用Materials Studio中的DMol3软件包完成，以确保高准确度与精度。
【数据】计算方法：DFT（PBE方法，DND3.5基组）；软件：Materials Studio DMol3；其他参数：原文未详述
2.5 抑制剂筛选方法
所建立的筛选方法由生物传感器模型与计算机辅助药物筛选模型两部分组成。该策略中，生物传感对复杂基质中的抑制剂进行初步筛选，随后由计算机辅助分析鉴定活性分子。将含200 μL 600 μg/mL黄嘌呤、50 μL Tris-HCl缓冲液（0.01 M，pH 8.0）、50 μL不同浓度（5.0–30.0 μg/mL）黄嘌呤氧化酶（XOD）、300 μL 200 μg/mL TMB和300 μL 100 μg/mL Fe-COF的反应混合液于室温孵育10 min。随后加入100 μL终止液终止催化反应。孵育结束后，用紫外-可见分光光度计测定450 nm处吸光度。以虎杖苷为阳性对照，扎那米韦、氨苄西林钠和阿加曲班为阴性对照验证生物传感器模型的可靠性。在相同条件下，选取一系列大分子、小分子和离子，统一浓度50 μg/mL，在阳性药物存在时评价生物传感方法的抗干扰能力。
【数据】黄嘌呤：200 μL（600 μg/mL）；Tris-HCl：50 μL（0.01 M，pH 8.0）；XOD：50 μL（5.0–30.0 μg/mL）；TMB：300 μL（200 μg/mL）；Fe-COF：300 μL（100 μg/mL）；孵育温度：室温；孵育时间：10 min；终止液：100 μL；检测波长：450 nm；阳性对照：虎杖苷；阴性对照：扎那米韦、氨苄西林钠、阿加曲班；干扰物浓度：50 μg/mL
本研究使用AutoDockTools进行分子对接研究，以识别潜在结合分子。黄嘌呤氧化酶的晶体结构（PDB ID：8J79）取自RCSB PDB数据库（https://www.rcsb.org/）。通过系统检索橡子相关文献，获得橡子中82种化合物，作为后续计算机辅助虚拟药物筛选研究的候选分子库。首先，去除靶蛋白结构中存在的水分子，以避免对接过程中的干扰。随后，加入极性氢原子以优化氢键网络，并赋予Gasteiger电荷以描述蛋白的静电性质。对于结构中断裂或缺失的侧链，使用AutoDockTools默认参数进行修复与建模，以确保蛋白结构的完整性与准确性。使用Meeko工具处理配体分子，Meeko为每个配体分子赋予原子电荷，以保证对接过程中适当的静电性质。检测并设置分子中的可旋转键，以允许配体在对接过程中进行柔性构象采样。随后，生成每个配体的3D构象，以覆盖其可能的结合模式。分子对接完成后，所有结合模式依据预测结合亲和力排序。选取排名前15的结合构象进一步分析，以确保所筛选分子具有高结合亲和力。最后，进行分子动力学模拟，评价活性成分与黄嘌呤氧化酶之间的相互作用。
【数据】软件：AutoDockTools、Meeko；蛋白结构：XOD（PDB ID：8J79）；候选化合物：82种；电荷类型：Gasteiger；可旋转键：已设置；选取构象：排名前15；分子动力学模拟：已进行（参数原文未详述）
2.6 生物传感法筛选活性天然药物
通过从天然产物中筛选XOD抑制剂，实现所建筛选方法的实用性。选取橡子、连翘、辛夷、当归、芦荟、桑叶、苦参、鸡内金、三七、厚朴、枇杷叶、栀子、薏苡仁、山慈菇、萆薢、泽泻、槐米、木香、益智仁、山茱萸、夏枯草、知母、银杏、决明子、射干、女贞子、槟榔、何首乌、白术、川芎。中药材样品经粉碎过筛，超声乙醇提取，浓缩、干燥，得粗提物。（中药材粗提物制备……）
【数据】药材：30种（橡子、连翘、辛夷、当归、芦荟、桑叶、苦参、鸡内金、三七、厚朴、枇杷叶、栀子、薏苡仁、山慈菇、萆薢、泽泻、槐米、木香、益智仁、山茱萸、夏枯草、知母、银杏、决明子、射干、女贞子、槟榔、何首乌、白术、川芎）；提取方式：粉碎过筛、超声乙醇提取、浓缩、干燥；提取参数：原文未详述
研究结果
3.1 Fe-COF的制备与表征
以TAPB和BPA为原料，在Fe(OTf)₂和乙酸存在下，Fe-COF（图S1A）于室温快速缩聚而成。扫描电子显微镜图像与透射扫描电子显微镜图像（图S1B、C）显示，所制备的Fe-COF具有堆叠的纳米块状结构。能量色散X射线谱图像表明，Fe、C、N元素在整个TEM元素映射区域均匀分布（图S1D）。傅里叶变换红外分析证实Fe-COF成功合成（图S1E），其中包含胺基（vN-H约3300 cm⁻¹）和大部分醛基（vC=O约1709 cm⁻¹）的消耗。此外，采用X射线光电子能谱分析Fe-COF的化学态（图S1F），显示出Fe 2p、O1s、C 1s和N 1s的明显峰。如图S1G所示，C1s谱在292.3 eV处有归属于CF的峰，288.9 eV处为C=O，286.1 eV处为C-N，285.2 eV处为C-N，284.5 eV处为C-C/C=C。如图S1H所示，Fe-COF中主要的N峰位于399.9 eV，其中亚胺N位于399.2 eV，N-Fe/NH₂位于401.9 eV。如图S1I所示，Fe-COF的Fe 2p扫描显示两个分裂的自旋轨道峰，分别位于约710.07 eV（2p3/2）和723.52 eV（2p1/2），并在715.78 eV和730.11 eV处有两个卫星峰[49]。
【数据】原料：TAPB、BPA；金属源：Fe(OTf)₂；酸：乙酸；合成温度：室温；形貌：堆叠纳米块；元素分布：Fe、C、N均匀；FT-IR：vN-H约3300 cm⁻¹、vC=O约1709 cm⁻¹；XPS峰位：C1s 292.3/288.9/286.1/285.2/284.5 eV，N1s 399.9/399.2/401.9 eV，Fe2p 710.07/723.52 eV，卫星峰715.78/730.11 eV
3.2 Fe-COF的类酶活性评价
在H₂O₂存在下，Fe-COF表现出过氧化物酶样活性，可催化TMB发生颜色变化，示意图见图2A。本研究以TMB和H₂O₂为显色底物检测Fe-COF的过氧化物酶活性。如图2B、C所示，当Fe-COF、TMB、H₂O₂单独存在，或Fe-COF与TMB、Fe-COF与H₂O₂、TMB与H₂O₂存在时，紫外-可见（UV–Vis）光谱中均未观察到特征吸收峰。当Fe-COF、TMB和H₂O₂同时存在时，反应体系出现显著颜色变化，加入终止液后，以450 nm为中心的特征吸收带增强，表明Fe-COF具有过氧化物酶样活性。在为期五天的储存稳定性测试中，Fe-COF在三个独立批次中表现出可靠的重现性与稳定性（图S2）。如图S3所示，上清液吸光度可忽略不计，与TMB + H₂O₂空白对照相当，且远低于Fe-COF，表明催化活性来源于固有的固态活性位点，而非浸出的离子。Fe-COF对TMB和H₂O₂均表现出较低的Km值，表明其对两种底物均具有高亲和力（图S4和表S1）。
【数据】显色底物：TMB、H₂O₂；特征吸收波长：450 nm；储存稳定性测试：5天、3个独立批次；上清液吸光度：可忽略；Km：较低（具体数值原文未详述，见表S1）；Vmax：原文未详述
为进一步验证Fe-COF的过氧化物酶样催化性质，采用叔丁醇、L-组氨酸和对苯醌清除剂鉴定H₂O₂还原过程中产生的自由基。如图S5所示，含叔丁醇体系的催化能力受到显著抑制。结合EPR进一步阐明反应路径，以5,5-二甲基-1-吡咯啉-N-氧化物（DMPO）为自旋捕获剂，通过EPR检测·OH，证实了参与反应的·OH自由基的形成。如图2D所示，当Fe-COF加入H₂O₂ + DMPO体系时，EPR谱呈现四个特征峰，强度比为1:2:2:1，对应于DMPO-•OH加合物。不含Fe-COF的对照体系未观察到此类信号。这些结果证实Fe-COF催化H₂O₂分解生成•OH自由基，与TMB比色结果一致，并解释了Fe-COF的过氧化物酶样活性。该催化行为与Guo等综述的功能位点设计策略一致，其报道称将金属配位中心引入COF基材料可赋予其固有催化性能[50]。本研究中，Fe–Nₓ配位位点是酶模拟催化活性的主要来源。
【数据】清除剂：叔丁醇、L-组氨酸、对苯醌；自旋捕获剂：DMPO；EPR特征峰：4个，强度比1:2:2:1；活性物种：•OH；活性位点：Fe–Nₓ配位
采用密度泛函理论研究了Fe-COF中活性中心的存在及其催化机制。首先，优化了H₂O₂在Fe-COF上不同位置的吸附构型（图2E）。此外，进一步研究了Fe-COF的前线分子轨道（图2F、G）。Fe-COF的HOMO与LUMO轨道差异较小，为0.68 eV，表明Fe金属化成功实现了带隙的显著调控。这种窄带隙特征主要归因于Fe 3d轨道的引入，其将金属相关电子态引入原有机框架带隙中，从而有效降低HOMO-LUMO能隙。随后，模拟了·-OH的生成过程，确定·-OH的形成路径如下：H₂O₂通过吸附在Fe-COF活性位点生成，随后分解形成两个OH键，其中一个OH从表面脱附生成·-OH（图2H、I）。H₂O₂在Fe-COF表面附近的吸附势垒为−3.26 eV，表明Fe-COF能够捕获H₂O₂。同时，H₂O₂转化为2OH的势垒为−6.07 eV，随后OH从Fe-COF表面脱附（2OH − OH*OH）为−5.27 eV，表明Fe-COF具有良好的POD样活性。
【数据】HOMO-LUMO能隙：0.68 eV；H₂O₂吸附势垒：−3.26 eV；H₂O₂→2OH势垒：−6.07 eV；OH*脱附能：−5.27 eV；计算方法：DFT（PBE/DND3.5）
3.3 酶活性检测
酶活性检测原理如图3A所示。在黄嘌呤氧化酶存在下，黄嘌呤被氧化生成过氧化氢。Fe-COF具有过氧化物酶样活性，可催化过氧化氢还原生成羟基自由基，后者氧化TMB生成特征性有色产物。颜色变化肉眼可见，无需先进仪器即可方便地监测黄嘌呤氧化酶活性。如图3B所示，黄嘌呤、黄嘌呤氧化酶、TMB和COF的组合产生显著颜色变化，并伴随最高的UV–Vis吸光度，验证了实验的可行性。此外，通过测定5至30 μg/mL浓度范围内黄嘌呤氧化酶在450 nm处的吸光度构建校准曲线，获得线性关系（y = 0.053x + 0.060，R² = 0.9980）（图3D）。基于校准曲线，使用公式LOD = 3.3σ/k和LOQ = 10σ/k计算检出限（LOD）和定量限（LOQ）分别为1.48 μg/mL和4.49 μg/mL，其中σ为回归线的残差标准差（Sy/x），k为校准曲线的斜率。结果表明，基于Fe-COF的XOD活性检测方法可行。
【数据】XOD浓度范围：5–30 μg/mL；校准曲线：y = 0.053x + 0.060；R²：0.9980；检测波长：450 nm；LOD：1.48 μg/mL；LOQ：4.49 μg/mL；公式：LOD = 3.3σ/k，LOQ = 10σ/k
通过对不同结构的生物分子进行综合分析，系统评价了Fe-COF对XOD的特异性与选择性，包括黄嘌呤氧化酶、过氧化氢酶、脲酶、α-葡萄糖苷酶、乳糖、卵清蛋白、乙酰胆碱酯酶、脂肪酶、胰蛋白酶、漆酶、β-半乳糖苷酶和葡萄糖氧化酶。如图3C所示，含XOD体系的UV–Vis吸光度显著高于其他大分子，表明基于Fe-COF的XOD检测体系具有良好的特异性与选择性。如图3E所示，12个样品组结果的相对标准偏差为3.3%，表明该检测方法重现性良好。此外，进行了干扰试验，图3F显示离子（Mg²⁺、Ca²⁺、K⁺、Cu²⁺、NH₄⁺、Zn²⁺、Fe³⁺、Na⁺、Ba²⁺、Al³⁺）的测试结果，图3G显示大分子（胰蛋白酶、乙酰胆碱酯酶、β-半乳糖苷酶、葡萄糖氧化酶、卵清蛋白、牛血清白蛋白、脂肪酶、淀粉酶、溶菌酶、漆酶）的测试结果，图3H显示氨基酸（酪氨酸、亮氨酸、缬氨酸、半胱氨酸、色氨酸、异亮氨酸、丝氨酸、脯氨酸、组氨酸、精氨酸）的测试结果……
【数据】选择性评价对象：12种生物分子（XOD、过氧化氢酶、脲酶、α-葡萄糖苷酶、乳糖、卵清蛋白、乙酰胆碱酯酶、脂肪酶、胰蛋白酶、漆酶、β-半乳糖苷酶、葡萄糖氧化酶）；重现性：12组样品，RSD = 3.3%；干扰离子：10种；干扰大分子：10种；干扰氨基酸：10种；检测波长：450 nm
3.4 天然药物筛选与活性验证
（原文此处接图3的30种天然药物比色传感筛选结果与图4的活性验证内容，节选未提供对应文字段落，故不另作翻译。）
讨论与解读
本研究将纳米酶比色生物传感器与计算机辅助虚拟筛选整合为XOD靶向抑制剂筛选平台。该平台可简便、快速地监测XOD活性，并在样品水平成功识别橡子提取物的XOD抑制活性；经虚拟筛选，从橡子化学成分中鉴定出purpurogallin为XOD抑制剂。体外酶学实验证实其抑制XOD的IC₅₀为177.69 μM，细胞实验进一步在高尿酸血症细胞模型中证明其降尿酸作用。这些结果共同构成概念验证：生物传感与计算策略的整合，为从复杂天然产物中发现活性分子提供了有用途径。鉴于其比色读出方式，未来工作可将该平台拓展至便携式可视化检测形式，用于现场筛查应用。
编译者解读：该研究的聪明之处在于"分工"——纳米酶传感器只回答"哪个样品有活性"，把昂贵精密的仪器分析留给后续计算与验证环节，从而以极低成本完成30种药材的初筛。Fe-COF的Fe–Nₓ活性位点设计也提示，COF材料的功能化配位是构建稳定纳米酶的可控路径。局限同样明显：比色法依赖单一450 nm读出，复杂提取物自身色素的干扰在节选中未见系统评估；从82个候选分子到1个活性分子的命中，也尚未给出虚拟筛选评分与实测抑制强度的相关性统计。
参考来源
期刊：Microchemical Journal, 2026
DOI: 10.1016/j.microc.2026.119657
DOI: 10.1016/j.microc.2026.119657