来源：Rational engineering-based scalable production of Morus alba urease in Pichia pastoris optimized biofermenter for industrial silkworm rearing（International Journal of Biological Macromolecules）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
桑叶来源的脲酶是人工饲料养蚕体系中的关键功能蛋白，但天然提取产量低、批次差异大、纯化困难，长期制约其工业化应用。本研究将桑树（Morus alba）脲酶基因（AB479106.1）经密码子优化后导入毕赤酵母，结合FoldX理性设计与Box-Behnken响应面优化，在3 L补料分批生物反应器中实现了重组脲酶的规模化分泌表达。纯化后的合成野生型酶比活达2967 U·mg⁻¹，T₅₀为71.4 °C，对家蚕卵巢细胞及蚕体相关微生物均表现良好生物相容性——为养蚕业提供了一个可放大、宿主适配的植物源脲酶生产平台。
研究背景
养蚕是最具可持续性的农业产业之一，高品质生丝带来的经济与文化价值显著。但人工饲料体系的发展始终受制于一个瓶颈：脲酶来源。桑叶中的脲酶参与氮代谢与营养同化，对维持家蚕生长、代谢健康与产丝量至关重要，然而其大规模获取极为困难。传统植物提取面临回收率低、批次间波动大、纯化技术难度高等问题；先进的提取纯化工艺虽已存在，成本却难以支撑规模化使用。其他植物源脲酶添加入人工饲料后，曾导致蚕体内尿素积累而脲酶活性缺失。刀豆脲酶虽与家蚕血淋巴纯化抗体存在交叉反应（6株单抗中4株识別），却有报道其对昆虫具毒性。与此同时，全球脲酶市场在亚太农业需求与植物源脲酶需求的推动下持续扩张，预计到2033年复合年增长率达6.74%。在此背景下，开发一种发酵罐兼容、功能表现可重复的桑树脲酶，成为养蚕工业亟待解决的课题。
研究方法
2.1 试剂、菌株、质粒与底物
桑树脲酶基因（GenBank登录号AB479106.1）与表达质粒pPIC9r购自上海天霖生物科技有限公司（中国上海）。用于定点突变的引物由SnapGene 6.0.2设计，并由生工生物工程（南京）有限公司合成。DNA测序与His-Tag纯化试剂盒（HyPur Ni-TED 6FF）购自生工生物（中国南京）。DMT感受态细胞（大肠杆菌）购自全式金生物（中国北京）。毕赤酵母GS115购自美国加州Carlsbad。分子生物学试剂，包括Pfu DNA聚合酶、BglII、T4 DNA连接酶、DMT酶及核酸纯化试剂盒，购自Omega Bio-tek（中国上海）与诺唯赞生物（中国南京）。抗His-Tag抗体、Western blot膜及试剂盒购自碧云天（中国上海）。超滤管（10 kDa MWCO）与商品化刀豆脲酶购自Sigma-Aldrich（中国）。TC-100昆虫培养基与FBS分别购自AppliChem（德国）与Thermo Fisher Scientific（美国）。荧光显微镜为OLYMPUS IX3（日本）。其余所有化学试剂均为分析纯，购自上海阿拉丁生化科技有限公司（中国上海）。
【数据】基因：桑树脲酶AB479106.1；质粒：pPIC9r；宿主：毕赤酵母GS115、大肠杆菌DMT；超滤膜截留：10 kDa；培养基：TC-100；原文未详述其余试剂用量
2.2 理性设计指导的工程改造以增强脲酶稳定性
采用FoldX5算法（版本3.0，http://foldx.crg.es/）作为YASARA插件，以全原子描述方法测定脲酶的折叠自由能。野生型桑树（白桑）晶体结构（UniProtKB标识符B9A9C8）用于FoldX5的能量（ΔG）计算评估。应用"Position scan"功能，计算并获得43个残基突变为其他氨基酸时的ΔG值。基于ΔG计算与残基柔性，选定一组热点（表S1）用于全质粒聚合酶链反应（PCR）介导的定点突变。脲酶三维结构及其突变体的同源建模与商业化可视化使用ChimeraX（版本1.11.1）与PyMOL（版本3.1）完成。桑树脲酶基因经密码子优化后，插入pPIC9r质粒中AOX1启动子下游，以适配毕赤酵母表达。
【数据】算法：FoldX5 v3.0；晶体结构：UniProtKB B9A9C8；扫描残基：43个；可视化软件：ChimeraX v1.11.1、PyMOL v3.1；启动子：AOX1；原文未详述温度等参数
2.3 定点突变
定点突变采用全质粒重叠PCR策略，使用突变特异性引物对（表S2）。PCR反应体系包含DNA模板（WT合成脲酶）、正向与反向引物、Pfu Flymix预混液及ddH₂O。PCR程序为：98 °C初始变性1 min；随后30个循环，每个循环98 °C变性10 s、54 °C退火10 s、72 °C延伸2 min 30 s；最后72 °C终延伸5 min。扩增产物在1%琼脂糖凝胶上以100 V电泳45 min分析。上样前，PCR产物于95 °C煮沸2 min，并在4 °C快速冷却30 s。显示正确大小条带的突变构建体（图S1B）用DMT酶处理以去除亲本质粒，随后通过热激转化导入大肠杆菌DMT感受态细胞。阳性转化子用AOX引物进行菌落PCR筛选（图S1C）。在补充氨苄青霉素的Luria-Bertani培养基（LB-Amp）中培养2 h后，阳性菌落质粒经DNA测序进一步验证（图S1D）。
【数据】变性：98 °C 1 min；循环数：30；变性：98 °C 10 s；退火：54 °C 10 s；延伸：72 °C 2 min 30 s；终延伸：72 °C 5 min；电泳：1%琼脂糖、100 V、45 min；煮沸：95 °C 2 min；冷却：4 °C 30 s；培养：LB-Amp、2 h
2.4 毕赤酵母生物反应器优化
重组质粒用BglII线性化，线性化产物经DNA纯化试剂盒纯化。纯化DNA随后转化入毕赤酵母（GS115）感受态细胞——该感受态细胞采用山梨醇法制备，电击转化（模式PIC，2000 V，5 ms）。表达参数采用Box-Behnken设计结合响应面法（RSM）优化，并作轻微修改。使用Design Expert 12软件（Stat-Ease，美国）执行Box-Behnken设计（BBD），考察三个独立变量对脲酶pH稳定性与热稳定性的影响，即：搅拌转速（X₁，rpm）、pH（X₂）与甲醇百分比（X₃，% v/v）。每个因素设三个水平：X₁（200、220、240 rpm）、X₂（5.5、6.5、7.5）、X₃（0.5、0.625、0.75%），编码为−1、0、+1（表S3）。BBD随机选取十七个实验运行。采用响应与编码变量之间的二阶多项式方程建模：
y(C) = A₀ + X₁ + X₂ + X₃ + X₁X₂ + X₁X₃ + X₂X₃ + X₁² + X₂² + X₃²
其中y(C)为预测响应，A₀为常数项，X₁、X₂、X₃分别为搅拌、pH与甲醇%的线性系数。pH稳定性方程：
y_pH = 65.27 + 8.20X₁ + 8.79X₂ + 11.60X₃ + 6.66X₁X₂ + 0.51X₁X₃ + 8.85X₂X₃ + 10.24X₁² + 0.94X₂² + 0.08X₃²
热稳定性方程：
y_TS = 90.90 + 0.64X₁ + 0.00X₂ + 3.50X₃ + 2.29X₁X₂ + 0.14X₁X₃ + 0.00X₂X₃ + 4791.32X₁² + 4737.78X₂² + 0.04X₃²
采用方差分析（ANOVA）评估响应中线性项、交互项与二次项的显著性（表S4）。上述方程进一步用于生成三维响应面图与等高线图——其中一个变量保持均值不变，另两个变量变化，以考察对脲酶稳定性的协同效应。
【数据】电击参数：模式PIC、2000 V、5 ms；变量水平：X₁ 200/220/240 rpm、X₂ 5.5/6.5/7.5、X₃ 0.5/0.625/0.75%；实验运行数：17；软件：Design Expert 12；pH稳定性模型R²与热稳定性模型R²见结果部分
2.5 蛋白表达与纯化
采用最小葡萄糖（MD）平板筛选转化子，并在标准生长培养基上按最优表达条件培养。随后挑选转化子，接种于酵母提取物蛋白胨葡萄糖（YPD）培养基（30 mL，含2%葡萄糖、2%蛋白胨、1%酵母提取物），30 °C、220 rpm振荡培养48 h。之后，取2 mL预培养液接种至200 mL缓冲甘油复合培养基（BMGY），30 °C、220 rpm培养。48 h后，将BMGY培养基（pH 6.5）中的酵母从培养液中移出，转接至200 mL含0.75%甲醇的缓冲甲醇复合培养基（BMMY），30 °C、220 rpm培养。每12 h补加0.75%甲醇以诱导酶分泌。诱导持续48 h，上清液于4 °C、4500 ×g离心10 min；收集含分泌蛋白的澄清上清用于蛋白纯化。溶液经10 kDa截留分子量（MWCO）膜超滤，重复操作直至达到所需浓度，同时将缓冲液置换为结合缓冲液（20 mM磷酸钠、300 mM NaCl，pH 7.4）。浓缩蛋白进一步按厂商说明经Ni-TED亲和层析纯化His-Tag脲酶。上样前Ni-TED树脂用结合缓冲液平衡；上样后，层析柱用含20 mM咪唑的洗涤缓冲液充分洗涤以去除非特异性结合蛋白。重组脲酶用含250 mM咪唑的洗脱缓冲液洗脱。洗脱组分经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分析，浓缩胶8%、分离胶10%，合并含目标蛋白的组分。蛋白浓度采用Bradford法测定，以牛血清白蛋白（BSA）为标准品。合并蛋白经超滤缓冲液置换重新浓缩，用于下游应用。
【数据】YPD：30 mL、2%葡萄糖、2%蛋白胨、1%酵母提取物、30 °C、220 rpm、48 h；BMGY：200 mL、pH 6.5、30 °C、220 rpm、48 h；BMMY：200 mL、0.75%甲醇、30 °C、220 rpm、诱导48 h；补料：每12 h补0.75%甲醇；离心：4500 ×g、10 min、4 °C；超滤：10 kDa MWCO；结合缓冲液：20 mM磷酸钠、300 mM NaCl、pH 7.4；洗涤：20 mM咪唑；洗脱：250 mM咪唑；SDS-PAGE：8%浓缩胶、10%分离胶
2.6 纯化脲酶的生化表征
脲酶活性通过苯酚-次氯酸盐比色法测定尿素水解释放的氨进行定量。标准反应体系（1.0 mL）……（原文节选至此，后续步骤未详述）
【数据】方法：苯酚-次氯酸盐比色法；反应体系：1.0 mL；原文未详述其余参数
研究结果
3.1 面向毕赤酵母生物反应器的桑树基因构建
桑树（白桑）脲酶基因（GenBank登录号AB479106.1；2546 bp）经密码子优化，以改善其在毕赤酵母中异源表达的翻译适配性。图S1A展示了优化基因的完整性——正确的开放阅读框、序列长度，以及无移码地正确插入pPIC9r表达载体（经测序验证），所得重组质粒总大小为11,841 bp。pPIC9r-合成脲酶构建体用引物ureA-F与ureA-R（表S2）扩增，并成功转化入大肠杆菌（DMT），用于后续定点突变与表达实验。该表达质粒的有效构建与测试产生了可行的合成型桑树脲酶，进一步用于毕赤酵母生物反应器中的脲酶生产。
【数据】基因长度：2546 bp；质粒总大小：11,841 bp；载体：pPIC9r；宿主：大肠杆菌DMT；原文未详述温度时间
3.2 重组脲酶的分子动力学（MD）模拟分析
基于FoldX预测的ΔG值，预测了43个单点突变位点（表S1）。使用表S2所列引物对所有预测位点进行定点突变。筛选阳性克隆，43个突变体中仅8个突变体（C113N、S121L、N206V、N206E、T297I、A304T、L364I与R782V）在琼脂糖凝胶上产生强条带（图S1B），随后转化入大肠杆菌DMT细胞进行序列验证。其中，4个突变体（C113N、N206E、A304T与R782V）成功转化入DMT（图S1C），序列验证后，3个突变体（N206E、A304T与R782V）被选入后续实验（图S1D）。这表明低转化率是多因素造成的。GC富集区的突变可能降低PCR扩增与克隆效率，导致35个计算机预测突变位点被排除在PCR之外。某些点突变导入大肠杆菌后造成代谢负担，导致宿主表达系统不稳定，仅获得4个成功转化子。这一有限的转化子数量说明脲酶具有严格的催化与结构要求。图1A展示了理性设计指导的蛋白工程——通过氨基酸替换获得成功转化子：A304T（Ala→Thr）、N206E（Asn→Glu）与R782V（Arg→Val）。图1B将这三个FoldX预测热点映射到野生型酶上，显示多数能量有利的突变位点位于活性位点远端，从而可在不损害催化功能的前提下进行稳定性工程。
热力学与结合自由能（ΔG(Binding)，kJ/mol）分析在318 K下（图1C）证实，三个突变体均保留了底物结合亲和力，其中A304T表现出最有利的结合自由能−8.99 kJ/mol（p < 0.01），最接近WT（−9.58 kJ/mol）。FoldX分析结果显示，A304T与N206E突变酶分别具有轻度至强烈的结构稳定化作用，而318 K下的结合能计算显示突变体底物亲和力较WT略有下降。这些发现表明，整体结构稳定性并不必然对应更高的底物结合与催化活性，因此需要实验验证。通过比较野生型与突变酶的局部结构，分析了替换的稳定化效应（图S2）。N206E突变引入额外静电相互作用，可能降低局部柔性；A304T替换形成新氢键，略微增强局部堆积与结构刚性；R782V则通过以疏水残基替换带电残基，缓解了C端区域的位阻与静电张力。替换残基结合模式的差异可归因于其理化性质，而未损害生化特性。N206E引入一个负电侧链，可增强局部静电相互作用；A304T提供氢键潜力而不显著破坏局部结构；R782V将体积较大的带电精氨酸变为较小的疏水残基，可能缓解位阻与静电张力。这些变化不在催化区域，不太可能直接影响催化机制。这与WT及各突变体的Kₘ和k_cat值一致——突变更可能影响局部底物容纳或可及性，而非催化周转。总体而言，数据表明非催化区域的FoldX指导突变未显著影响催化周转（k_cat），但局部侧链相互作用可影响底物容纳程度与表观亲和力（Kₘ）。
【数据】预测突变位点：43个；凝胶强条带突变体：8个；成功转化：4个；入选实验：3个（N206E、A304T、R782V）；A304T结合自由能：−8.99 kJ/mol（p < 0.01）；WT结合自由能：−9.58 kJ/mol；分析温度：318 K；排除位点：35个
3.3 毕赤酵母生物反应器优化
图S3展示了基于Box-Behnken设计（BBD）实验的三维响应面与等高线图，说明搅拌（X₁）、培养基pH（X₂）与甲醇浓度（X₃）的交互效应。这些图直观证实了各因素如何影响合成脲酶的pH与热稳定性。BBD分析确定的最优条件为220 rpm搅拌、pH 6.5、0.75%（v/v）甲醇（图S3）。虽然可用多种测定评估酶活与动力学，我们优先关注重组酶的pH与热稳定性——这与主要目标一致，即聚焦生理相关条件下植物源、宿主特异性的合成酶。详细结果汇总于表S4。ANOVA分析表明，pH稳定性与热稳定性的回归模型均具统计学显著性（p < 0.05），且决定系数高（pH稳定性R² = 0.8896，热稳定性R² = 0.9993），证实二次模型适用于预测酶性能（表S5）。失拟检验不显著（p > 0.05），变异系数低，预测值超过均值预测偏差相对于足够精度指标（>4），进一步验证了实验设计与模型的可靠性。这些结果表明搅拌、pH与甲醇浓度强烈影响酶稳定性。表S6展示了所有BBD组合的活性测定，表明毕赤酵母生长条件强烈影响脲酶表达与活性。相对活性变化达1至3.43倍，说明实验条件对催化活性与酶稳健性的影响。酶在pH 7–11范围内保持活性，证实碱性pH下的功能稳定性。热稳定性在45 °C以上逐渐下降，85 °C时保留20%活性，提示高温诱导的活性位点破坏。不同培养基条件下的这些变化表明，这些参数直接影响毕赤酵母表达系统中的细胞密度、氧传递、分泌动力学与蛋白折叠效率，从而影响酶活性。这一系统优化代表了宿主系统的设计—构建—测试—学习指导的改进，以增强酶功能。220 rpm搅拌、pH 6.5、0.75%（v/v）的培养基条件表现出最佳结果：相对活性提高1.38倍，25 °C下热稳定性94.7%，45 °C下65.7%，最高比活986 U·mg⁻¹。总体而言，这些发现表明，将析因分析与中心点验证相结合，确定了后续酶表达的最佳发酵参数。为此验证，采用补料分批发酵策略在3 L生物反应器中进行规模化生产……
【数据】最优条件：220 rpm、pH 6.5、0.75%甲醇；pH稳定性模型R²=0.8896；热稳定性模型R²=0.9993；失拟检验p>0.05；相对活性变化：1–3.43倍；活性pH范围：7–11；85 °C残留活性：20%；相对活性提升：1.38倍；热稳定性：25 °C 94.7%、45 °C 65.7%；最高比活：986 U·mg⁻¹；反应器体积：3 L
讨论与解读
本研究首次报道了桑树脲酶的理性设计、工程改造及其在优化毕赤酵母生物发酵系统中的成功异源表达。工程变体N206E、A304T与R782V表现出稳定、具催化活性且生物学安全的特性。优化发酵条件（pH 6.5、220 rpm、0.75%甲醇）实现了高效分泌与高酶产率，重组WT脲酶比活2967 U·mg⁻¹、Kₘ 1.60 mM、k_cat 10,142 s⁻¹、T₅₀ 71.4 °C、最适pH 9.0。结构与热力学分析表明，非催化区域突变增强了稳定性，但未改善底物亲和力。生物安全评估显示对BmN细胞无毒性，对蚕体相关微生物无不良影响。放大至3 L生物反应器进一步提高了蛋白产量、生产力与热稳定性，展现出良好的工艺重复性与工业潜力。研究为安全、可放大、宿主特异性的合成桑树脲酶平台提供了初步基础，在可持续养蚕与生物技术领域具有应用前景。不过，仍需通过家蚕饲喂试验进行直接验证；未来研究应评估对家蚕生长、产丝与肠道微生物互作的长期影响，同时测试更广泛的突变体并优化补料分批发酵。
编译者解读：该研究的可取之处在于把"酶稳定性工程"与"发酵工艺优化"两条线并置推进——FoldX先筛远端热点避开活性位点，再用BBD锁定培养参数，逻辑闭环清晰。但需注意，理性设计阶段43个预测位点最终仅3个进入实验，转化效率瓶颈暴露了脲酶结构容忍度之低；且所有变体的底物亲和力均未超越WT，说明"稳定"与"活性"在该酶上存在取舍。真正决定其养蚕业价值的，仍是尚未开展的家蚕饲喂试验。
参考来源
期刊：International Journal of Biological Macromolecules, 2026
DOI: 10.1016/j.ijbiomac.2026.155024
DOI: 10.1016/j.ijbiomac.2026.155024