来源：Uncovering lignin metabolism in Myceliophthora thermophila toward integrated lignocellulose valorization（Bioresource Technology）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
木质素占植物生物量近三分之一，却长期是生物炼制的"废弃物"。本研究系统解析了嗜热子囊菌 Myceliophthora thermophila 的木质素代谢能力：该菌能修饰木质素骨架、利用多种木质素来源芳香单体，并通过转录组与基因敲除定位了β-酮己二酸途径的关键节点。敲除原儿茶酸羟化酶与3,4-双加氧酶基因后，H型和G型单体转化为3,4-二羟基苯甲酸的摩尔产率达42.5‒95.8%，并实现从原玉米芯直接生产。这为整合型木质纤维素生物炼制提供了新底盘。
研究背景
木质素是由对香豆醇、松柏醇和芥子醇经自由基聚合形成的天然芳香聚合物，与纤维素交织、与半纤维素共价连接，赋予植物细胞壁结构与抗微生物侵袭能力。其含量可达植物细胞壁干重的三分之一，是陆地生态系统中仅次于纤维素的第二大生物聚合物。将木质素转化为高值生物产品，可减少对石油基原料的依赖——但无论来自天然原料还是工业过程，木质素结构极端复杂且抗降解，高效转化始终是难题。
微生物（真菌与细菌）已进化出修饰、降解甚至利用木质素聚合物的能力。自然界中，丝状真菌是木质素分解的主力；传统观点认为木质素降解主要发生于担子菌，如白腐真菌能高效降解和修饰木质素聚合物。相比之下，子囊菌在木质素周转中的贡献长期被低估。M. thermophila 是成熟的植物生物质转化平台，但其木质素代谢能力"很大程度上尚未被探索"——这正是本研究要填补的空白。
研究方法
2.1 菌株、培养基与培养条件
M. thermophila ATCC 42464（WT，野生型）购自美国典型培养物保藏中心。本研究所用突变体列于补充材料。M. thermophila 菌株培养于含2%（w/v）葡萄糖的Vogel基本培养基（VMM，即GMM）上，含1.5%琼脂，35 °C培养7天以获得成熟分生孢子。VMM每升含：2.6 g Na3C6H5O7·2H2O、2.52 g KNO3、2.88 g NH4H2PO4、1.6 g KH2PO4、0.2 g MgSO4·7H2O、0.1 g CaCl2·2H2O、0.0025 mg生物素、1 mL微量元素溶液。微量元素溶液每升含：50 g C6H8O7·H2O、50 g ZnSO4·7H2O、10 g Fe(NH4)2(SO4)2·6H2O、2.5 g CuSO4·5H2O、0.5 g MnSO4·H2O、0.5 g H3BO3、0.5 g NaMoO4·2H2O（Davis and de Serres, 1970）。
为探究 M. thermophila 利用木质素及木质素来源底物的可能性，将碱木质素（AL；Solarbio，CAS: 8068-05-1；货号L8500，北京索莱宝）、脱碱木质素（DAL；CAS: 9005-53-2；批号C13390217；上海麦克林）、木质素来源芳香化合物（阿拉丁）和玉米芯粉（40目；含水量7.64%；内蒙古；华润双鹤药业有限责任公司）分别作为唯一碳源提供。按制造商规格，AL为深棕色粉末（水中溶解度可达100 mg/mL）；DAL为黄至黑色固体，含水量≤20%，灼烧残渣10.0–20%，pH 3.0–4.0（50 g/L）。
生长表型分析：WT及突变体接种于补充不同碳源的VMM琼脂平板（1.5%琼脂，直径90 mm），每株接种2 µL含1 × 10^5 个孢子的悬液，45 °C培养。液体摇瓶培养：50 mL补充不同碳源的VMM调pH至6.0，接入终浓度1 × 10^6 个孢子/mL的分生孢子于250 mL三角瓶，45 °C、150 rpm振荡培养。
3,4-DHB生产实验：分生孢子以终浓度1 × 10^6 个/mL接入50 mL培养基（250 mL三角瓶），培养基为VMM补充1%（w/v）葡萄糖及0.5%（w/v）4-羟基苯甲酸（4-HBA）、0.2%（w/v）4-香豆酸、0.05%（w/v）苯甲酸、0.1%（w/v）阿魏酸、0.1%（w/v）香草酸或0.025%（w/v）香草醛。玉米芯产3,4-DHB实验：每升培养基含75 g玉米芯粉、3 g KH2PO4、4.48 g K2HPO4、0.1 g MgSO4·7H2O、0.1 g CaCl2·2H2O、8 g Bacto蛋白胨、1 mL生物素（0.1 g/L）、1 mL微量元素溶液（Vogel盐）。所有培养均45 °C、150 rpm。3,4-DHB摩尔产率按3,4-DHB滴度最高时间点的底物消耗量计算：产率（mol/mol）= 生成的3,4-DHB摩尔数 / 消耗的底物摩尔数。为确认3,4-DHB生产源于木质素而非玉米芯其他组分，将葡萄糖、木糖、纤维素（Avicel PH-101）和木聚糖（山毛榉来源，Sigma）各以75 g/L作为唯一碳源提供。
【数据】菌株：M. thermophila ATCC 42464（WT）；培养基：VMM/GMM；琼脂：1.5%；葡萄糖：2%（w/v）；产孢温度：35 °C；产孢时间：7天；接种孢子量：2 µL（1 × 10^5 个）；培养温度：45 °C；摇床转速：150 rpm；液体装量：50 mL/250 mL；接种浓度：1 × 10^6 个孢子/mL；pH：6.0；玉米芯粉：75 g/L；玉米芯含水量：7.64%；AL溶解度：≤100 mg/mL；DAL含水量：≤20%；DAL灼烧残渣：10.0–20%；DAL pH：3.0–4.0（50 g/L）
2.2 基因表达与缺失的质粒构建
本研究所用全部引物序列与质粒列于补充材料。基因缺失：构建携带供体DNA的载体。目标基因5'和3'侧翼区从 M. thermophila 基因组DNA扩增；PtrpC-neo选择标记盒及含氨苄青霉素抗性基因（ampR）的pAN52骨架从质粒pAN52-PtrpC-neo扩增（Liu et al., 2023）。5'和3'侧翼片段与PtrpC-neo标记盒用NEB Gibson组装试剂盒组装，生成供体质粒。
sgRNA表达质粒构建：基于 M. thermophila 基因组序列，用sgRNACas9工具（Xie et al., 2014）鉴定目标基因内的靶位点；选择预测脱靶效应低的寡核苷酸，对应原型间隔序列见补充材料。M. thermophila U6启动子、RNA聚合酶III U6 snRNA基因及pJET1.2/blunt骨架直接从质粒U6-pck-sgRNA扩增（Liu et al., 2023），用NEB Gibson组装试剂盒组装成sgRNA表达质粒。Cas9表达盒（Ptef1-Cas9-TtprC）用引物Ptef-cas-F/TtprC-cas-R从质粒p0380-bar-Ptef1-Cas9-TtprC经PCR扩增（Liu et al., 2017）。
香草醛脱氢酶基因过表达：构建质粒pAN52-OE-vdhA-bar和pAN52-OE-Mtvdh-bar。vdhA基因从 A. niger CBS 513.88的cDNA扩增，Mtvdh从 M. thermophila 基因组DNA扩增；片段用NEB Gibson组装试剂盒插入pAN52-PgpdA-TtrpC-PtrpC-bar骨架的PgpdA启动子与TtrpC终止子之间。
【数据】质粒骨架：pAN52、pJET1.2/blunt；选择标记：PtrpC-neo（遗传霉素）、bar（草铵膦）；启动子：PgpdA、Ptef1、PtrpC、U6；组装试剂盒：NEB Gibson；Cas9来源质粒：p0380-bar-Ptef1-Cas9-TtprC；vdhA来源：A. niger CBS 513.88 cDNA；Mtvdh来源：M. thermophila 基因组DNA
2.3 毁丝霉原生质体转化
采用聚乙二醇（PEG）介导的原生质体转化进行基因破坏与过表达，方法参照先前描述并稍作修改（Wang et al., 2015）。M. thermophila 孢子接入30 mL GMM，45 °C、150 rpm培养12 h。萌发孢子经3,220g离心10 min收集，用1 M MgSO4洗涤两次，重悬于含10 mg Trichoderma harzianum 裂解酶（Sigma）的10 mL 1 M MgSO4中。随后加入20 mL山梨醇–Tris–HCl–CaCl2（STC）溶液（1.2 M山梨醇、10 mM Tris–HCl，pH 7.5、50 mM CaCl2）。悬液3,220g离心10 min，STC洗涤两次，最终重悬于STC。
转化：200 µL原生质体悬液与10 µg PCR产物混合，60 °C孵育2 min。CRISPR/Cas9介导的基因破坏：10 µg Cas9表达PCR盒（Ptef1-Cas9-TtprC）、sgRNA表达PCR盒与相应供体片段按1:1:1摩尔比混合后加入真菌原生质体。基因过表达：10 µg PCR产物用于转化。随后加入50 µL 60%（w/v）PEG 4000溶液（含50 mM CaCl2、10 mM Tris–HCl，pH 7.5），室温孵育20 min。混合液转入50 mL离心管，补加2 mL 60% PEG 4000溶液，室温再孵育5 min。用20 mL STC稀释后3,220g离心10 min，沉淀重悬于1 mL STC。转化原生质体悬液涂布于补充遗传霉素（100 µg/mL）或草铵膦（100 µg/mL）的GMM琼脂平板，培养3天筛选neo或bar抗性转化子。转基因存在经PCR确认（见补充材料）。
【数据】孢子预培养：30 mL GMM、45 °C、150 rpm、12 h；离心：3,220g、10 min；裂解酶：10 mg/10 mL；STC：1.2 M山梨醇、10 mM Tris–HCl（pH 7.5）、50 mM CaCl2；原生质体用量：200 µL；DNA用量：10 µg；热激：60 °C、2 min；PEG 4000：60%（w/v）、50 µL + 2 mL；室温孵育：20 min + 5 min；抗性筛选浓度：遗传霉素100 µg/mL、草铵膦100 µg/mL；筛选时间：3天
2.4 代谢物分析与菌丝干重测定
纤维素、半纤维素和木质素含量按美国国家可再生能源实验室方法分析（Sluiter et al., 2021）。简要流程：0.3 g干燥样品与3 mL 72%（w/w）H2SO4混合，30 °C孵育1 h；水解液用水稀释至硫酸终浓度4%（w/w），121 °C高压灭菌1 h。释放的糖用高效液相色谱（HPLC）定量，配备Bio-Rad Aminex HPX-87H柱和Waters 2414示差检测器，40 °C；流动相为5 mM H2SO4，流速0.5 mL/min。酸不溶木质素含量测定的原文节选在此处中断（原文未详述后续步骤）。
【数据】样品量：0.3 g；H2SO4：3 mL、72%（w/w）；水解温度/时间：30 °C、1 h；稀释后酸浓度：4%（w/w）；灭菌：121 °C、1 h；HPLC柱：Bio-Rad Aminex HPX-87H；检测器：Waters 2414、40 °C；流动相：5 mM H2SO4；流速：0.5 mL/min
研究结果
3.1 *M. thermophila* 对商品木质素的利用与结构修饰
M. thermophila 虽是纤维素和半纤维素酶解研究的成熟模型，但其木质素同化能力基本未被探索。为评估该菌利用商品木质素制剂的能力，将AL和DAL分别作为唯一碳源。鉴于木质素被报道具有抗微生物特性，我们首先在GMM中补充不同浓度（0.2–2%，w/v）的AL或DAL，评估其对 M. thermophila 的潜在毒性。对AL而言，各测试浓度下生物量积累无显著差异（图1A）。相反，DAL表现出明显抑制作用，生物量随浓度升高显著下降。2% DAL条件下，M. thermophila 的DCW较葡萄糖对照下降91.3%。高DAL条件下还观察到明显形态异常，包括菌丝顶端显著膨大（见补充材料）。
为探究AL与DAL抑制效应不同的可能原因，我们分析了无菌培养基中的芳香单体。1% DAL中检测到0.046 g/L香草醛、0.034 g/L邻苯二酚和0.005 g/L丁香醛，而这些化合物在1% AL中含量低得多（见补充材料）。这些结果表明，DAL中较高丰度的抑制性芳香单体可能部分解释其更强的抑制作用——后续实验证实了这一点。
接下来评估 M. thermophila 以AL或DAL为唯一碳源的生长。培养3天后，含0.2% AL、1% AL和2% AL的培养物DCW分别达0.51、1.02和1.77 g/L（图1B）。而含DAL的培养物无论浓度如何，仅观察到可忽略的生物量积累（<0.07 g/L）。对未处理与真菌处理3天的1% AL培养物回收木质素进行FTIR光谱分析，整体谱型相似，表明木质素芳香骨架基本保留（见补充材料）。与未处理样品相比，真菌处理木质素在3419 cm−1（O–H伸缩）、2922 cm−1（脂肪族C–H伸缩）和1716 cm−1（羰基伸缩）处强度降低；1619和1514 cm−1处特征芳香骨架振动带也略有下降。此外，1325（紫丁香基环呼吸与C–O伸缩）、1122（S单元芳香C–H面内变形）和1041 cm−1（脂肪族醇/醚C–O伸缩）处观察到中度下降。FTIR结果提示，M. thermophila 主要修饰木质素官能团，同时基本保留芳香聚合物骨架。
GPC分析进一步揭示真菌培养后木质素分子量分布的变化（见补充材料）。培养3天后，数均分子量（Mn）从497.9降至409.7 Da（降低17.7%），重均分子量（Mw）从664.6降至629.3 Da（降低5.3%）。同时多分散指数（PDI）从1.335升至1.536，表明真菌处理后分子量分布变宽。这些结果说明 M. thermophila 部分修饰了木质素结构，使残余木质素向更低分子量和更宽分子量分布偏移。
【数据】AL浓度：0.2–2%（w/v）；2% DAL：DCW下降91.3%（vs 葡萄糖）；1% DAL芳香单体：香草醛0.046 g/L、邻苯二酚0.034 g/L、丁香醛0.005 g/L；3天DCW：0.2% AL 0.51 g/L、1% AL 1.02 g/L、2% AL 1.77 g/L；DAL培养DCW：<0.07 g/L；FTIR：3419、2922、1716、1619、1514、1325、1122、1041 cm−1；GPC：Mn 497.9→409.7 Da（−17.7%）、Mw 664.6→629.3 Da（−5.3%）、PDI 1.335→1.536
3.2 *M. thermophila* 对生物质内嵌木质素的利用
随后以玉米芯（2%，w/v）为唯一碳源，研究天然植物生物质中木质素的利用。培养3天后，76.5%的纤维素和71.0%的半纤维素被消耗，木质素含量下降约31.7%（图1C）。纤维素、半纤维素和木质素同步减少，表明 M. thermophila 生长中可同时获取多种生物质组分，而非依赖单一多糖组分。第3天培养物的靶向代谢物分析显示，与对照相比木质素来源芳香化合物发生显著变化（见补充材料）。例如，丁香酸积累，而4-香豆酸和咖啡酸随培养进程下降。这一模式提示木质素来源芳香化合物被持续释放并随后代谢，而非简单积累。
基于已建立的真菌木材腐朽FTIR解析（Pandey and Pitman, 2003），进行FTIR分析以研究结构变化。碳水化合物相关特征带——1733 cm−1（木聚糖中非共轭CO）、1375 cm−1（多糖C−H变形）、1048 cm−1（C−O伸缩）、1158 cm−1（C−O−C振动）和898 cm−1（β-糖苷键）——显著下降，表明 M. thermophila 优先去除纤维素和半纤维素（图1D）。相反，1605和1514 cm−1处木质素相关芳香骨架振动相对强度增加，与多糖耗竭导致的木质素富集一致。同时，其他木质素相关谱带（如归属于紫丁香基和愈创木基单元的1325和1122 cm−1）部分下降。一致地，SEM显示表面严重破坏，包括粗糙度、孔隙率和碎片化增加，真菌菌丝黏附并穿透底物（见补充材料）。这些结果表明，M. thermophila 优先消耗碳水化合物组分，同时诱导木质素的部分解聚与重塑。
木质素相关官能团的修饰及木质素来源芳香代谢物的检出表明，M. thermophila 能修饰生物质内嵌木质素并利用释放的木质素来源芳香化合物。尽管木质素降解传统上被视为白腐担子菌的特征，越来越多证据表明子囊菌也参与自然生态系统中的木质素周转（Dou et al., 2022; Ferrari et al., 2021; Li et al., 2024）。与此一致，M. thermophila 基因组编码若干推定胞外氧化还原酶，包括漆酶、阿魏酸酯酶和推定木质素修饰过氧化物酶（Berka et al., 2011）。这些酶可能参与木质素来源芳香化合物的释放，但其具体生理作用仍待实验验证。
【数据】玉米芯：2%（w/v）；3天消耗：纤维素76.5%、半纤维素71.0%；木质素下降：约31.7%；FTIR碳水带：1733、1375、1048、1158、898 cm−1；木质素带：1605、1514（相对增强）、1325、1122 cm−1（部分下降）
3.3 *M. thermophila* 对多种木质素来源芳香化合物的同化
木质素通常在微生物同化前解聚为低分子量芳香化合物。我们前期研究通过Biolog实验显示 M. thermophila 可利用木质素来源芳香化合物4-HBA（Liu et al., 2022）。鉴于该菌可利用商品木质素和玉米芯中的木质素，我们进一步研究哪些具体木质素来源单体可支持其生长。共评估12种代表性木质素来源芳香化合物——涵盖紫丁香基（S）、愈创木基（G）和对羟基苯基（H）衍生物——作为唯一碳源。在摇瓶培养、各单体浓度0.1%（w/v）条件下，其中7种单体不同程度支持真菌生长（图2A和B）。相反，3种醛类木质素单体（香草醛、丁香醛和松柏醛）以及邻苯二酚和愈创木酚上未观察到生长，可能归因于其严重的细胞毒性。不同浓度下的进一步分析显示，M. thermophila 对这些芳香物表现出差异耐受性，在……（原文节选在此处中断，后续内容未详述）。
【数据】测试单体：12种（S/G/H型）；支持生长：7种；测试浓度：0.1%（w/v）；不支持生长：香草醛、丁香醛、松柏醛、邻苯二酚、愈创木酚；培养方式：摇瓶
3.4 转录组分析与关键基因敲除（据图3、图4图注及摘要）
摘要指出，本研究整合转录组分析与靶向基因敲除，绘制了这些芳香化合物的关键代谢通路。具体而言，M. thermophila 将多种H型和G型芳香单体汇入β-酮己二酸途径的3,4-二羟基苯甲酸（原儿茶酸，3,4-DHB）分支。图3为 M. thermophila 木质素来源芳香化合物同化的转录组分析：热图展示候选基因在多种木质素来源芳香物下的表达谱（Z-score标准化log2转换RPKM；数据为三个独立生物学重复的均值）（原文图注节选）。图4展示基因缺失对木质素来源芳香物利用的影响：不同突变体摇瓶培养的菌丝DCW（A）与残余4-HBA（B）；WT与缺失突变体在以4-HBA（0.1%，w/v；5天）为唯一碳源的琼脂平板上的表型（C）；以及……（图注原文在此中断）。
【数据】转录组：3个独立生物学重复；数据形式：Z-score标准化log2转换RPKM；平板4-HBA浓度：0.1%（w/v）；培养时间：5天
3.5 过表达香草醛脱氢酶增强芳香醛利用（据图5图注及摘要）
图5展示通过过表达香草醛脱氢酶增强 M. thermophila 对芳香醛的利用。图注显示：AlphaFold 3预测的AnVdhA与MtVdhA三维结构比较（A）；WT、OE-AnvdhA和OE-MtvdhA在含VMM补充……的琼脂平板上的生长表型（图注原文在此中断）。结合方法部分，vdhA来自 A. niger CBS 513.88，Mtvdh来自 M. thermophila 基因组，均置于PgpdA启动子下过表达。
【数据】结构预测工具：AlphaFold 3；过表达菌株：OE-AnvdhA、OE-MtvdhA；启动子：PgpdA；基因来源：A. niger CBS 513.88 cDNA、M. thermophila 基因组DNA
3.6 工程菌株产3,4-DHB及原玉米芯直接合成（据图6图注及摘要）
摘要给出核心数据：破坏原儿茶酸羟化酶与3,4-双加氧酶基因成功重定向代谢流，从H型和G型单体获得42.5‒95.8%的3,4-DHB摩尔产率；工程菌株实现从原玉米芯直接生产3,4-DHB。图6展示工程 M. thermophila 产3,4-DHB评估：（A）通过生物漏斗策略从玉米芯直接生物合成3,4-DHB；（B）WT、ΔprcA和ΔprcAΔphyA中由4-HBA合成的3,4-DHB积累；（C）生物转化过程中4-HBA消耗的时间进程（图注原文在此中断）。
【数据】3,4-DHB摩尔产率：42.5‒95.8%（H型与G型单体）；关键敲除基因：prcA（原儿茶酸羟化酶）、phyA（3,4-双加氧酶）；菌株：WT、ΔprcA、ΔprcAΔphyA；底物：4-HBA；原料：原玉米芯
图7 | 图注：（原文未提供图注）
讨论与解读
本研究证明 M. thermophila 可在含木质素培养基中生长并代谢多种木质素来源芳香化合物。通过转录组分析与功能验证相结合，绘制了H、G、S型芳香单体降解的主要代谢通路；对下游途径的代谢工程使3,4-DHB能从多种木质素来源芳香底物乃至原玉米芯高效积累。研究拓展了对嗜热真菌芳香代谢的认识，并凸显 M. thermophila 用于木质素增值的潜力。
编译者解读：该研究的巧妙之处在于"以用代解"——不追求彻底开环降解木质素，而是把顽固芳香物导入β-酮己二酸途径的3,4-DHB分支并截流，把分解难题转化为产物积累问题。42.5‒95.8%的摩尔产率与玉米芯直接发酵，显示了整合型生物炼制的可行性。局限也明显：DAL中芳香醛的毒性、S型单体利用细节及氧化还原酶生理角色仍待厘清，产率上限受底物毒性制约。
参考来源
期刊：Bioresource Technology, 2027
DOI: 10.1016/j.biortech.2026.136080
DOI: 10.1016/j.biortech.2026.136080