来源：Integrated kraft lignin solubilization, depolymerization, and fermentation by Pseudomonas putida KT2440 using tailored L-arginine:glycerol deep eutectic solvent-water system（Chemical Engineering Journal）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
硫酸盐木质素（KL）是制浆造纸工业的大宗副产物，年产量约7800万吨，却大多被直接燃烧。其溶解性差、结构顽固，传统碱法解聚又需高温强碱和繁琐中和。本研究筛选了七种低共熔溶剂（DES），发现L-精氨酸:甘油（L-Arg:Gly）在50% DES中可使KL溶解度达424.2 ± 26.88 g/L，即便稀释至2% DES仍保持6.9 ± 1.43 g/L。以2% DES、95 °C、1 h条件解聚后直接发酵，恶臭假单胞菌KT2440从OD600 = 0.1的低接种量出发，24 h内即进入指数期。但丁香基（S型）单体无法被充分利用，限制了总转化率。
研究背景
全球变暖、人口增长与化石燃料依赖，推高了对可再生资源和环境友好生产工艺的需求。木质纤维素生物质是低成本可再生原料，但其经济可行性取决于高效预处理方法。木质素作为木质纤维素中主要的天然酚类组分，可转化为高值化学品、材料和能源，备受关注。
制浆造纸工业是木质素的主要来源之一。硫酸盐制浆过程中，木材在150–170 °C下经氢氧化钠和硫化钠溶液处理实现脱木质素，该过程主要断裂β-芳基醚键（β-O-4醚键），而树脂醇单元（β−β）基本保持完整。随之发生的再缩合反应生成新的碳-碳（C−C）键，使KL结构更加顽固，难以进一步转化。如何在不使用苛刻条件的前提下实现KL的高效增溶与解聚，并将其直接对接微生物发酵，是木质素 valorization 的核心难题。
研究方法
2.1 化学品与化合物
硫酸盐木质素（KL）为源自桉树硬木的工业技术木质素，由Suzano Papel & Celulose（巴西）惠赠。用于制备DES、木质素解聚和发酵培养基的所有化学品和试剂均为分析纯或更高等级，除另有说明外均购自Sigma-Aldrich。其中包括氯化胆碱（CAS 67–48-1）、葡萄糖（CAS 492–62-6）、甘油（CAS 56–81-5；CHEMSOLUTE，德国）、乙二醇（CAS 107–21-1）、丙酸（CAS 79–09-4）、尿素（CAS 57–13-6）、L-精氨酸（CAS 1119-34-2）、L-脯氨酸（CAS 147–85-3）。用于定量和验证的标准木质素衍生酚类化合物包括香草酸（CAS 121–34-6）、丁香酸（CAS 530–57-4）、阿魏酸（CAS 537–98-4）、对香豆酸（CAS 501–98-4）和4-羟基苯甲酸（CAS 99–96-7）。
【数据】KL来源：桉树硬木工业技术木质素，Suzano Papel & Celulose（巴西）；试剂等级：分析纯或更高；供应商：Sigma-Aldrich；氯化胆碱CAS：67–48-1；葡萄糖CAS：492–62-6；甘油CAS：56–81-5；乙二醇CAS：107–21-1；丙酸CAS：79–09-4；尿素CAS：57–13-6；L-精氨酸CAS：1119-34-2；L-脯氨酸CAS：147–85-3；香草酸CAS：121–34-6；丁香酸CAS：530–57-4；阿魏酸CAS：537–98-4；对香豆酸CAS：501–98-4；4-羟基苯甲酸CAS：99–96-7
2.2 DES制备
DES通过将氢键受体（HBA）和氢键供体（HBD）按特定摩尔比混合制备（表1），随后在300 rpm持续搅拌下加热至形成均匀溶液。制备好的DES密封储存于室温，以防止实验使用前因吸湿或蒸发导致水含量变化。为研究水含量对KL溶解度的影响，将去离子水按重量法加入预先形成的DES中，获得水含量为50%、65%、80%、90%、95%和98%（w/w）的DES-水混合物。选择50%水含量作为下限，以避免更浓DES体系带来的高黏度、传质受限和操作困难。评估更高水含量是为了确定能否在降低DES消耗、减少引入后续微生物发酵的DES组分浓度的同时维持KL溶解度。由于高水含量可能破坏原始DES的分子间氢键网络，含80–98%（w/w）水的配方在本文中称为DES-水混合物。各DES的组成、摩尔比、制备温度及分组详见表1。初始制备温度基于已发表的相应或相近DES配方的程序选择。当报道温度在本实验条件下未能产生澄清均匀液体时，逐步升高温度直至形成澄清均匀溶液。这些配方特异性温度反映了DES组分在熔融行为、黏度和混合要求上的差异。每种DES混合物搅拌至形成澄清均匀溶液。制备好的DES密封储存于室温，以防止实验使用前因吸湿或蒸发导致水含量变化。
【数据】搅拌转速：300 rpm；水含量梯度：50%、65%、80%、90%、95%、98%（w/w）；DES-水混合物定义：80–98%（w/w）水；储存条件：密封、室温；制备温度：基于文献，必要时逐步升高至澄清均匀
2.3 硫酸盐木质素浓度与溶解度评估
KL溶解度的测定方法改编自Sosa等。简言之，将过量KL加入Eppendorf管中的1 g DES或DES-水混合物溶液中，使各溶剂饱和。样品在40 °C、700 rpm持续振荡下于恒温混匀仪中孵育1 h。饱和点定义为管中未溶解KL仍以固体形式可见的条件，表明已超过溶解度。为分离不溶部分，将饱和样品以16,750 RCF、×g离心15 min。上清液（饱和液相）随后用二甲基亚砜（DMSO，99.9%，Honeywell，德国）稀释，再进行紫外-可见光谱分析。由于KL溶解度在测试溶剂体系间差异巨大，使用了6至8000倍不等的配方特异性稀释因子，以确保测得的KL浓度落在0.05–0.30 g/L的线性校准范围内（表S1）。KL浓度通过280 nm紫外-可见光谱定量（CLARIOstar Plus酶标仪）。使用相同KL在DMSO中已知浓度制备的标准校准曲线计算溶解度值（图S1）。原始上清液中的KL浓度通过将校准曲线测得的浓度乘以相应的总稀释因子计算（表S1）。所有溶解度测定均做三次重复。对于50%和65% L-Arg:Gly DES，因高黏度阻碍了可靠的相分离和体积稀释，未采用紫外-可见光谱定量。取而代之，将准确称量的KL增量加入已知质量的溶剂混合物中，在40 °C、700 rpm下平衡1 h。持续添加KL直至观察到持久不溶物。在首次出现不溶部分前完全溶解的KL累积质量，用于以质量基准计算溶解度，即每克溶剂混合物中KL的克数。数值利用实验测得的相应溶剂混合物密度转换为g/L（表S1）。所有溶解度测定均做三次重复。
【数据】KL加入量：过量至1 g DES或DES-水混合物；孵育温度：40 °C；振荡转速：700 rpm；孵育时间：1 h；离心条件：16,750 RCF、×g、15 min；稀释剂：DMSO（99.9%，Honeywell，德国）；稀释倍数：6–8000倍；校准范围：0.05–0.30 g/L；检测波长：280 nm；仪器：CLARIOstar Plus酶标仪；50%/65% L-Arg:Gly替代法：40 °C、700 rpm、1 h，质量基准；重复次数：三次
2.4 发酵培养基
所有发酵实验均使用M9基础盐培养基，补充de Bont微量元素和唯一碳源，碳源依实验条件而变化。M9盐培养基含3.0 g/L KH2PO4、7.52 g/L Na2HPO4·2H2O、1.0 g/L NH4Cl和0.5 g/L NaCl。高压灭菌前将pH调至7.0。微量元素按de Bont配方以最终1×浓度加入基础培养基。微量元素溶液含0.01 g/L EDTA、0.1 g/L MgCl2·6H2O、0.002 g/L ZnSO4·7H2O、0.001 g/L CaCl2·2H2O、0.005 g/L FeSO4·7H2O、0.0002 g/L Na2MoO4·2H2O、0.0002 g/L CuSO4·5H2O、0.0004 g/L CoCl2·6H2O和0.0011 g/L MnCl2·4H2O。微量元素储备液经0.22 μm膜过滤除菌，无菌加入高压灭菌后的M9培养基。根据各实验需要，加入不同的唯一碳源，包括选定的DES（L-Arg:Gly DES）或解聚KL。
【数据】培养基：M9基础盐；KH2PO4：3.0 g/L；Na2HPO4·2H2O：7.52 g/L；NH4Cl：1.0 g/L；NaCl：0.5 g/L；pH：7.0（高压灭菌前）；微量元素：de Bont配方，最终1×；EDTA：0.01 g/L；MgCl2·6H2O：0.1 g/L；ZnSO4·7H2O：0.002 g/L；CaCl2·2H2O：0.001 g/L；FeSO4·7H2O：0.005 g/L；Na2MoO4·2H2O：0.0002 g/L；CuSO4·5H2O：0.0002 g/L；CoCl2·6H2O：0.0004 g/L；MnCl2·4H2O：0.0011 g/L；过滤孔径：0.22 μm
2.5 选定DES及其单一组分在唯一碳源条件下对恶臭假单胞菌KT2440生长的影响
为评估选定DES（L-Arg:Gly）对KT2440生长的影响，该菌株在作为唯一碳源的不同浓度DES及其单一组分（L-Arg或甘油）存在下培养。培养使用Growth Profiler 960（Enzyscreen，Heemstede，荷兰）在96孔微板中进行，每孔工作体积300 μL。每孔接种初始细胞密度OD600 = 0.1，30 °C下以225 rpm连续振荡培养。通过自动图像检测每30 min监测生长，持续72 h。记录的绿色值通过Growth Profiler软件中的校准曲线转换为OD当量，生成OD600当量和生长曲线。所有实验均做三次重复。
【数据】仪器：Growth Profiler 960（Enzyscreen，荷兰）；微板：96孔；工作体积：300 μL/孔；初始OD600：0.1；温度：30 °C；振荡：225 rpm；监测间隔：每30 min；监测时长：72 h；重复次数：三次
2.6 硫酸盐木质素解聚测定
为确定使用选定DES进行KL解聚的整合导向折中条件，反应在DES或DES-水混合物浓度为2%、5%和50%（w/w）下进行。2%和5%条件代表与微生物过程整合相关的高度稀释DES-水混合物，而50%条件代表浓缩处理条件。2%（w/v）NaOH溶液作为代表性传统碱法基准，因为先前木质素解聚研究中常用可比的低浓度碱处理。每个反应在1 mL总体积中制备，含10%（w/v）KL固体负载。解聚在……（原文此处中断）
【数据】DES浓度：2%、5%、50%（w/w）；NaOH基准：2%（w/v）；反应总体积：1 mL；KL固体负载：10%（w/v）
研究结果
3.1 DES用于KL增溶的筛选与评价
为鉴定能增强KL溶解度的DES配方，制备了多组DES，包括羧酸基、多元醇基、糖基、多元醇-氨基酸基和多元醇-糖基（表1）。这些组基于先前报道的木质纤维素生物质预处理功效和木质素增溶效果，或因其与木质素衍生化合物协同并支持KT2440生长的潜力而选择。评估了KL在这些DES中的溶解度，发现所有含50%水的配方均显著改善KL增溶，优于纯水（图1，表S1）。
在DES中，由丙酸和尿素组成的羧酸基DES（PA:U，2:1摩尔比）表现出最高增溶能力，KL溶解度达473.90 ± 42.93 g/L。这与其他研究报道的羧酸基DES对木质素的高增溶效率和选择性一致。其有效性主要归因于羧基（–COOH）与木质素羟基形成强氢键。这些相互作用增强木质素增溶并促进关键结构键的断裂，尤其是β-O-4醚键——木质素解聚的主要目标之一，在羧酸基DES预处理木质纤维素生物质过程中显著减少。其他作者也报道PA:U是最有效的KL增溶DES之一，与我们的实验结果吻合。
有趣的是，多元醇-氨基酸基DES，尤其是1:5摩尔比的L-Arg:Gly，表现出显著性能，KL溶解度达424.19 ± 26.88 g/L。该DES兼具生物相容性、无毒、不挥发和不易燃，是生物加工中有趣的选择。此外，甘油为与KT2440生物转化的整合提供了优势，因为它可同时作为溶剂体系组分、发酵过程中可代谢的共底物，以及通过支持细胞能量生成和生物量形成潜在促进KT2440耐受性。而且，甘油是生物柴油生产的低成本副产物，作为发酵底物具有经济吸引力，从而增强生物加工应用的可扩展性。Rahman等报道L-Arg:Gly DES相比其单一组分显著降低熔点，尽管黏度相对较高。这些性质反映了强非共价相互作用，特别是氢键，其中L-精氨酸作为氢键受体，富含羟基的甘油作为氢键供体。值得注意的是，L-Arg:Gly DES还表现出高热稳定性，在150–160 °C下保持稳定而无显著质量损失，适合中温木质素解聚。
糖基和多元醇基DES表现出较弱的木质素增溶性能（图1）。尽管如此，这些组分具有生物学意义，因为据报道葡萄糖可促进细菌生长、增加耐受性并加速木质素衍生化合物的降解。多组学分析进一步揭示，向KT2440共喂葡萄糖和苯甲酸盐可通过增加TCA循环和苯甲酸盐降解途径的代谢活性来提高生长速率。然而，尽管有此生物学潜力，测试的不同摩尔比的糖基和多元醇基DES对KL表现出低溶解度（图1）。这些结果可解释为这些DES组分（如葡萄糖和甘油）中存在大量羟基。羟基的丰富增加了这些DES的极性，导致溶剂内形成致密氢键网络。这种内部键合可能限制DES与KL芳香结构之间的相互作用，从而阻碍其增溶。
虽然PA:U和L-Arg:Gly在改善KL溶解度方面高效且优于其他DES配方，但高浓度使用可能因潜在毒性而对直接发酵构成挑战。高DES水平可抑制细菌生长并降低整体生物转化效率。为解决此问题，我们研究了增加DES配方中水含量的效果。这种修改预期可降低底物成本并减轻高DES浓度的负面影响，从而增强木质素增溶和后续微生物发酵的可行性。
【数据】DES水含量：50%；PA:U摩尔比：2:1；PA:U的KL溶解度：473.90 ± 42.93 g/L；L-Arg:Gly摩尔比：1:5；L-Arg:Gly的KL溶解度：424.19 ± 26.88 g/L；L-Arg:Gly热稳定性：150–160 °C；统计显著性：t-test，p ≤ 0.05
3.2 不同水含量DES中硫酸盐木质素的溶解度
为研究水含量对DES中KL溶解度的影响，将PA:U和L-Arg:Gly DES用水稀释至50%至98%浓度。随后在40 °C下进行溶解度评估。结果显示，PA:U的KL溶解度增加，在65%水含量时达最大值495.72 ± 12.44 g/L。然而，进一步将水含量增至80%导致溶解度急剧下降至5.37 ± 0.85 g/L（图2，表S2）。相反，L-Arg:Gly的KL溶解度随水含量增加逐渐下降；但即使在高稀释水平下仍保持相对高的增溶能力。值得注意的是，在98%水含量（即仅2% DES-水混合物）时仍达到令人印象深刻的6.9 ± 1.43 g/L溶解度（图2）。
PA:U和L-Arg:Gly DES的增溶曲线均呈S形趋势，表明其作用机制遵循水溶助长行为（图2）。Soares等将DES的木质素增溶机制分为两类：水溶助长机制和共溶剂机制。在水溶助长机制中，DES作为水溶助剂形成聚集体，在木质素周围产生两亲性微环境，从而增强其溶解度。该过程通常产生S形溶解度曲线，正如我们的结果所观察到的。相反，共溶剂机制通过改变水的极性和溶剂化性质来线性或单调地增加溶解度，而不形成聚集体。我们的发现与该机制框架一致，支持水溶助长作为这些DES体系中KL增溶的主导模式。
尽管PA:U在中等水含量下表现出最高的绝对KL溶解度，但其增溶能力在进一步稀释后急剧下降。此外，丙酸可作为KT2440的碳源，但在高浓度下具有抑制作用，从而对PA:U与发酵的直接整合构成潜在挑战。相反，L-Arg:Gly在与微生物培养相关的高水含量下保持了显著更高的KL溶解度。因此选择L-Arg:Gly用于后续解聚和发酵研究，因为它在KL增溶和降低DES负载之间提供了更有利的平衡。此外，其组成也为过程整合提供了优势：甘油既可充当DES-水混合物组分，又可作为KT2440的共底物，而L-精氨酸可提供可代谢的碳和氮。基于这些特性，选择L-Arg:Gly DES-水混合物进一步研究，以评估其对KT2440生长的影响并评估其与微生物木质素生物转化的兼容性。
【数据】PA:U最大KL溶解度：495.72 ± 12.44 g/L（65%水含量）；PA:U在80%水含量时溶解度：5.37 ± 0.85 g/L；L-Arg:Gly在98%水含量时溶解度：6.9 ± 1.43 g/L；温度：40 °C；曲线类型：S形（水溶助长机制）
3.3 L-Arg:Gly DES对恶臭假单胞菌KT2440生长的影响
为评估L-Arg:Gly DES-水混合物用于木质素生物转化过程的适用性，研究了其对KT2440生长的影响……（原文此处中断）
【数据】原文未详述（节选至此中断）
讨论与解读
本研究系统评估了多种DES及DES-水混合物对KL溶解度的增强作用，并实现了其与解聚和微生物生物转化过程的直接整合。PA:U在中等水含量下表现出最高的绝对KL溶解度，但L-Arg:Gly在高稀释度下仍保持可测量的KL溶解度——98 wt%水时达6.90 ± 1.43 g/L，因而被选中，因为它在KL溶解度、降低DES组分负载和与后续微生物加工的兼容性之间提供了更有利的平衡。这种增强的溶解度促进了KL更高效的解聚，尤其在较高DES浓度（50% DES）下。此外，与传统的NaOH碱法解聚相比，它表现出明显优势，产生更高相对丰度的木质素衍生芳香族单体。使用50% DES时的这一观察结果展示了产物回收和未来溶剂循环的潜力。然而，检测器依赖的SEC结果提示可能存在竞争性的断裂和缩合，需要互补结构分析加以确认。生物过程整合需要战略性的生物相容性折中。因此，采用2% L-Arg:Gly DES-水混合物在95 °C下处理1 h，用于KT2440的直接KL增溶、解聚和发酵。该系统支持从低初始接种量（OD600 = 0.1）成功发酵，并缩短了时间……（原文此处中断）
编译者解读：该研究以L-精氨酸:甘油DES为纽带，把木质素增溶、解聚和发酵串成一条链，思路务实——用可代谢组分做溶剂，省去中和与换液。但S型单体无法被KT2440利用，暴露出产物谱与宿主代谢不匹配的硬伤。未来若能在菌株层面补齐丁香基代谢通路，或定向调控解聚选择性，这条路线才真正具备规模化价值。
参考来源
期刊：Chemical Engineering Journal, 2026
DOI: 10.1016/j.cej.2026.183016
DOI: 10.1016/j.cej.2026.183016